短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统的建立及应用

为了实现对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SCU11基因组连续地无痕改造,提高碱性蛋白酶产量,本文建立了基于Upp基因反向筛选的短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统,将碱性蛋白酶基因AprE的1份拷贝无痕插入至短小芽孢杆菌染色体16S rDNA区.摇瓶发酵实验显示,突变菌株碱性蛋白酶活最高达到7125 U/mL,与出发菌株相比提高了33.1%.结果表明利用该系统可实现对短小芽孢杆菌基因组的无痕修饰,对AprE插入突变菌株进行双交换筛选的最终效率约为23.07%.     

一株产海因酶菌种的筛选与鉴定

通过对土壤中微生物以单一海因类似物作为唯一氮源富集、分离和纯化,利用双层琼脂法筛选获得产海因酶菌株,以基因工程手段提取其DNA,并进行特异性的16S rDNA测序,最终利用Blastn工具将其基因序列与GenBank数据库中的进行序列比对。研究表明:该菌与Bacillus megateriumQM B1551(NC004604)序列相似性达到98%,证明该菌为巨大芽孢杆菌。     

深海抗锰细菌的分离鉴定

从太平洋深海底泥样品中富集、筛选得到50株锰抗性细菌, 16S rDNA鉴定结果表明这50株细菌中含有40株芽孢杆菌、3株短杆菌、1株短状杆菌、1株考克氏菌、4株副球菌和1株食烷菌.50株中80%是芽孢杆菌,有6个种.90%以上为革兰氏阳性菌.短小芽孢杆菌(B. pumilus)Mn12对Mn2 的耐受能力最好,最高的Mn2 耐受浓度是130 mmol/L.该菌在28℃以200 r/min培养24 h后,能去除含锰(Ⅱ)10 mmol/L培养基中90%的锰(Ⅱ)(锰含量由高碘酸盐分光光度法测定).而Mn59在同样条件下,可耐受30 mmol/L锰(Ⅱ),可去除99%的锰(Ⅱ),具有抗性高、去除率高、速度快的优点,具有极大的应用前景.     

1株羊蹄强拮抗内生芽孢杆菌H-g的分离鉴定

从羊蹄(Radix Rumicis Japonici)根中分离到1株对小麦赤霉(Fusarium graminearum)等多种植物病原真菌有强拮抗作用的内生芽孢杆菌H-g.通过形态特征和培养特征观察、生理生化实验及16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌属,命名为bacillus subtilis subsp H-g.     

高温大曲中两株产酱香菌的分离鉴定

为提高酱香型白酒风味,以高温大曲为原料,采用高温培养法和麸皮固体培养基固态发酵筛选出20株芽孢杆菌.通过对各菌株产香实验筛选出2株产酱香的芽孢杆菌(GX07和GX08),并结合菌株生理生化和16S rDNA基因序列对两株菌株进行鉴定.结果表明,GX07为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),GX08为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).     

一株耐高温α-淀粉酶生产菌的分离鉴定及其产酶条件优化

作者从四川成都及其周边地区的淀粉厂,米厂,面粉厂等样品采集地的土样和污水当中筛选到16株酶活较高的野生型α-淀粉酶生产菌,其中一株编号为C1的菌株酶活最高,液体发酵酶活达到20 U/mL.这株菌能在高温（50 ℃）下生长良好.在电子显微镜观察,有明显芽孢,生理生化常规鉴定为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）,进一步的16S rDNA分子鉴定确定该菌属于枯草芽孢杆菌,命名为B. subtilis C1. 并对B. subtilis C1的产酶条件进行优化.     

一株拮抗芽孢杆菌的分离鉴定及其β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆

 植物真菌病害是影响农业生产的主要因素之一,连作栽培导致病害逐年加重,为获得能够抑制病原真菌的生防菌以解决真菌病害防治难题,通过平板对峙实验及分子鉴定、抑菌活性物质分析、葡聚糖酶基因克隆及分析,获得一株对多种植物病原真菌具有显著抑制作用的芽孢杆菌,菌株编号为L103。16S rDNA及看家基因序列分析表明,该菌株为巨大芽孢杆菌,羧甲基纤维素钠平板筛选及刚果红染色实验发现该菌具有很强的产纤维素酶(CMC酶)的能力,根据GenBank中巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(HM130670.1)序列设计引物,将扩增得到的1482bp大小的片段克隆到载体pMD18-T上,测序并通过GenBank数据库BLAST分析显示该序列与一株Bacillus sp. HB102的内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列一致性达到95%,而与Bacillus subtilis的β-1,4-内切葡聚糖酶基因一致性为85%,进一步分析该菌株产生的抗病活性物质并对其进行改良将为该菌在今后的真菌病害防治应用中提供理论基础。     

16S rDNA与gyrB序列联合法鉴定一株蜡样芽孢杆菌

以从凝结芽孢杆菌活菌片中分离得到的一株YSSNJ-005菌株为目的菌株,经16S r DNA与gyr B序列联合法对其精确鉴定。研究结果表明:经过16S r DNA序列分析,初步判定菌株YSSNJ-005属芽孢杆菌属。由gyr B基因序列同源性分析及构建系统发育树对菌株YSSNJ-005继续鉴定。BLAST在线对比可知:菌株YSSNJ-005为芽孢杆菌属,且与蜡样芽孢杆菌标准菌株Bacillus cereus ATCC14579基因序列同源性达100%,可精确断定菌株YSSNJ-005是蜡样芽孢杆菌。     

产耐热过氧化氢酶菌株的筛选和培养

过氧化氢酶能催化过氧化氢的分解,在食品、环保、纸浆和造纸业、以及纺织行业具有重要的工业应用价值。研究从堆肥中分离了一株产过氧化氢酶的嗜热菌。该菌最适生长温度为55℃,最适生长pH值为7.0,最适NaCl浓度为1.5%。通过16S rDNA编码基因序列分析,该菌和环状芽孢杆菌有较高的同源性,命名为Bacillus sp.SHT2。通过对培养基中的碳、氮源进行优化,酶活达到196.9 U/mL。酶学性质研究表明该菌产生的过氧化氢酶具有良好的热稳定性、pH稳定性和储存稳定性。     

克氏原螯虾调理产品中主要腐败菌的分离鉴定

为了分离鉴定克氏原螯虾调理产品在4℃冷藏条件下的腐败菌菌相组成,将其在4℃条件下冷藏至货架期末(20 d左右),此时克氏原螯虾调理产品中菌落总数为7.05 logcfu/mL.采用传统分离纯化、菌落形态观察、生理生化鉴定与16S rDNA序列分析方法结合,对腐败菌进行分离鉴定.结果表明:在克氏原螯虾样品中共分离得到85株菌株,经镜检、生理生化鉴定以及16S rDNA测序得到5株典型优势菌,分别为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methlotrophicus)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococccus wameri)和溶酪巨型球菌(Macrococcus caseolyticus).     

一株盐湖芽孢杆菌AF-1的鉴定及其抗尖孢镰刀菌活性研究

盐湖作为一种特殊的极端环境,其中的微生物具有巨大的潜在应用价值.为了了解盐湖微生物的特性,对分离自山西运城盐湖的一株芽孢杆菌AF-1进行分类鉴定及抗菌特性研究.对该芽孢杆菌分类鉴定采用的是16s rDNA基因序列分析;以尖孢镰刀菌作为指示菌,采用杯碟法检测AF-1发酵上清液的抗菌活性,研究不同温度、pH、盐度条件对发酵上清液抗菌活性的影响,检测AF-1的生长曲线和抗生素产生量的关系及抗菌曲线;利用扫描电镜和透射电镜观察AF-1的抗菌效果;利用PCR技术对AF-1基因组进行抗菌功能基因PKS筛查.结果显示,16s rDNA基因序列的系统发育分析表明AF-1为Bacillus属成员,对尖孢镰刀菌有很好的抗性;AF-1发酵上清液在不同的温度、p H和NaCl浓度条件下均有很好的抗菌活性;显微镜检测和透射电镜结果显示,AF-1发酵上清液使尖孢镰刀菌细胞结构出现明显改变,并导致部分细胞质泄露;AF-1基因组中含有聚酮合酶PKS基因,可以用来合成抗生素前体物质.以上结果表明,从盐湖中分离的芽孢杆菌AF-1具有很好的抗尖孢镰刀菌的活性,可以作为抗菌活性物质的新菌种来源.     

深海抗锰细菌的分离鉴定

从太平洋深海底泥样品中富集、筛选得到50株锰抗性细菌，16S rDNA鉴定结果表明这50株细菌中含有40株芽孢杆菌、3株短杆菌、1株短状杆菌、1株考克氏菌、4株副球菌和1株食烷菌．50株中80％是芽孢杆菌，有6个种．90％以上为革兰氏阳性菌．短小芽孢杆菌（B．pumilus）Mn12对Mn^2＋的耐受能力最好，最高的Mn^2＋耐受浓度是130mmol／L．该菌在28℃以200r／min培养24h后，能去除含锰（Ⅱ）10mmol／L培养基中90％的锰（Ⅱ）（锰含量由高碘酸盐分光光度法测定）．而Mn59在同样条件下，可耐受30mmol／L锰（Ⅱ），可去除99％的锰（Ⅱ），具有抗性高、去除率高、速度快的优点，具有极大的应用前景．     

高效降解羽毛角蛋白菌株的筛选与鉴定

以羽毛角蛋白作为唯一碳源和氮源,从长期堆积腐烂羽毛的土壤中分离出一株高效降解羽毛角蛋白的菌株.通过对该菌株形态特征观察、生理生化实验测定、16S,rDNA序列分析和Biolog系统鉴定,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),且命名为地衣芽孢杆菌F4.F4在50,℃条件下摇瓶发酵48,h,角蛋白酶活达到23,U/mL.该菌能够降解完整的天然羽毛,具有开发应用前景.     

鸟苷产生菌解淀粉芽孢杆菌的选育

出发菌GR001通过形态观察、生理生化实验、16S rDNA同源性序列分析及部分特异性基因序列分析鉴定为解淀粉芽孢杆菌.以GR001为出发菌,通过化学诱变选育出一株遗传标记为腺嘌呤营养缺陷、6–巯基嘌呤抗性以及蛋氨酸亚砜抗性(Ade-+MSOr+6-MPr)的突变株GR600.以GR600为受体菌,采用原生质体转化法获得转化子GR607(Ade-+MSOr+6-MPr+kmr),鸟苷产量高达20.82,g/L.     

牛源纤维素降解菌的分离筛选与鉴定

为了提高牛粪中的纤维素降解效率,筛选牛粪发酵菌剂的优良菌种,采用连续稀释平板法,以羧甲基纤维素纳(CMC-Na)为碳源,从新鲜牛粪和腐熟牛粪中对纤维素降解菌株进行初步分离。对所得菌株进行纤维素水解圈测定,并进一步采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活,再结合菌落形态、生化反应特性和16S rDNA序列分析进行菌种鉴定。研究结果表明:从牛粪样品中初步分离得到了56株纤维素降解菌,进一步水解圈测定筛选出13株菌,其中菌株NA10的水解圈最大,水解圈直径与菌落直径比值(H/C)为5.35,该菌纤维素酶活(CMC)和滤纸酶活(FPA)分别为55.13 U/mL和35.47 U/mL。观察NA10菌落呈乳白色圆盘状,表面光滑不透明。显微镜下,可见NA10经革兰氏染色呈阳性,为短杆状、链状排列,中生芽孢。生化反应显示NA10符合芽孢杆菌属安全芽孢杆菌的特征。经16S rDNA基因序列分析鉴定,该菌株为芽孢杆菌属的安全芽孢杆菌(Bacillus safensis),将其命名为Bacillus safensis NA10。本文分离得到一株具有降解纤维素潜力的菌株,可作为制备发酵菌剂的优势菌种之一。     

一株α-淀粉酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化

从湖南省长沙县养殖场牛胃秸秆发酵物中筛选获得了一株高产α-淀粉酶的菌株,命名为SCUEC8.通过对其形态学观察和生理生化特性,结合16S rDNA序列对比分析,初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).探讨了不同碳源、氮源、培养条件等因素对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株产酶的影响,结果表明：在培养时间为16 h、pH为6.0、培养温度为37℃、碳源为20.0 g·L^-1的麦芽糖、氮源为15.0 g·L^-1的胰蛋白胨、金属离子为1.0 g·L^-1的Mn²⁺时,枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和α-淀粉酶的活性较高.     

一株产耐高温淀粉酶菌株DW027的鉴定

结合表型性状分析和16S rRNA序列及系统发育分析进行菌株的鉴定.结果显示,DW027菌体呈杆状,革兰氏染色阳性,产芽孢.在LB平板培养基上,菌落呈白色、圆形.16S rRNA基因序列分析表明,与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)标准序列的同源性达99％,初步鉴定为枯草芽孢杆菌.     

原油降解菌群对石油烃的生物演化过程研究

本研究从大港油田受原油污染的土壤中筛得6株原油降解菌,通过生理生化特征实验、16S rDNA分子生物学鉴定和气相色谱(GC-FID)分析,对石油烃降解菌群的生物演化规律进行研究.结果表明,筛得的6株主要为假单胞菌和芽孢杆菌,芽孢杆菌与假单胞菌均为原油降解的优势菌种.将这6株菌按照相同体积比配制成YJ01混合菌处理含油海水,降解7 d后,混合菌群对中链、长链烃的降解效果较好;混合菌对奇碳数烃的降解优势更明显.     

华北地区圈养大熊猫粪便中产纤维素酶芽孢杆菌菌株的分离与鉴定

为分离筛选大熊猫肠道中具有纤维素降解能力的芽孢杆菌菌株,首先对8份大熊猫粪便进行高温水浴处理,利用刚果红平板法进行初筛和复筛,DNS法测定酶活力.结果分离出126株菌株,其中8株菌株纤维素降解能力较强.结合形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析,鉴定8个菌株均属于芽孢杆菌属,其中1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),1株阿萨尔基芽孢杆菌(B.axarquienis),2株西姆芽孢杆菌(B.siamensis),4株甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus).实验表明大熊猫肠道中存在多种降解纤维素的芽孢杆菌,其中新发现的有大熊猫源的阿萨尔基芽孢杆菌和西姆芽孢杆菌,丰富了大熊猫肠道菌群的研究,并为高效生产纤维素酶提供新的菌种来源.探究了大熊猫消化道内高效的纤维素降解菌,有利于实现高纤维类饲料资源化利用.     

番茄灰霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及评价

为分离鉴定一些对番茄灰霉菌具有拮抗作用且适合当地生境的生防细菌,以金华连续10年的番茄种植保护地土壤为材料,分离细菌,并以灰霉菌为靶标菌对其拮抗效果进行检验,对候选菌株进行格兰氏染色,将其16S rDNA序列与GenBank中已知标准菌株的16S rDNA序列比对,利用Neighbor-joining方法构建进化树,通过菌株发酵液灌根番茄后48 h,离体叶片挑战接种番茄灰霉菌,以及温室盆栽接种实验明确其防治效果.结果显示:分离获得5株疑似芽孢杆菌,其中1株(JH-2)对番茄灰霉病菌具有较高抗性,鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),与标准菌株AB735995.1解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)聚于同一分支,同源性高达99%;菌株JH-2发酵液处理的番茄叶片病斑面积为对照处理的77%,防治效果为22.3%;菌株JH-2处理后对番茄灰霉的防治效果为38.9%.以上结果表明,解淀粉酶芽孢杆菌JH-2灌根后,可以触发番茄植株系统抗病性,增强植株免疫能力.