文昌鱼酸性磷酸酯酶的化学修饰

用DEAE-纤维素(DE-22)并改进酶的提纯方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酶制剂比活力为359μM/mg(E)/min(Npp为底物)·用凝胶过滤法测得该酶分子量为58600,氨基酸组成有20种,共467个氨基酸残基。10~(-4)M pCMB使酶活力丧失98％;1×10~(-3)M PMSP该酶活力丧失96％,2×10~(-4)M NBS以及1×10~(-2)M BrAc酶活力均丧失90％·酶修饰失活呈一级反应,修饰过的酶紫外280nm吸收峰消失·初步判断文昌鱼AcPase分子上的Cys,Trp,His,Ser等氨基酸残基可能是酶的活力必需基团。     

家蚕碱性磷酸酶的功能基团研究

用PCMB、NBS、PMSF、TNBS、SUAN、DTT、BrAc、IAc等在一定条件下选择性修饰家蚕碱性磷酸酶的部分氨基酸残基,对酶活力的变化进行测定.结果表明:PMSF、SUAN、BrAc、IAc和TNBS的修饰能显著抑制酶的活性,且酶活力降低程度与修饰剂的浓度相关;PMSF、DTT和NBT的修饰对酶的影响较小.初步认为,巯基和组氨酸的咪唑基可能是家蚕碱性磷酸酶的必需功能基团,赖氨酸残基和二硫键对保护酶的催化能力是必需的.     

僧帽牡蛎碱性磷酸酶功能基团的研究

采用化学修饰法研究僧帽牡蛎碱性磷酸酶活性功能基团性质.酶经0.4mmol·L-1PCMB修饰30min后活力仍然保持不变,提示巯基与酶的活力无关;用二巯基苏糖醇(DTT)对酶进行修饰,当DTT浓度达到2.5mmol·L-1时,酶活力丧失98%,表明硫 硫键与酶活力有密切的关系;以N 溴代琥珀酰亚胺(NBS)修饰酶的色氨酸残基,酶的修饰失活呈一级反应,当NBS浓度达到0.65mmol·L-1时,酶活力丧失100%,并辅以紫外吸收光谱的变化分析,表明色氨酸残基是酶催化活力所必需的;醋酸酐、马来酸酐、甲醛等氨基试剂对酶的修饰作用显示氨基是酶的必需基团.     

长毛对虾碱性磷酸酶功能基团的研究

用对－氯汞苯甲酸修饰该酶分子中的巯基，酶活力不受影响，说明该酶不是“巯基酶”．用Ｎ溴代琥珀酰亚胺修饰酶后，活力完全丧失，修饰后的酶在２７５ｎｍ处的紫外吸收峰完全消失，３４０ｎｍ处荧光发射峰也逐渐下降至完全淬灭，说明色氨酸残基是酶活性必需基因之一．用甲醛、醋酸酐修饰氨基，溴代乙酸修饰咪唑基也可以使酶活力完全丧失，说明赖氨酸残基及组氨酸残基也是酶活性功能基因．用乙酰丙酮修饰精氨酸残基，酶活力下降了５０％，精氨酸残基可能与维系酶分子构象有关．     

背角无齿蚌碱性磷酸酶的功能基团研究

在一定条件下，分别采用ＰＭＳＦ，ＤＴＴ，ＰＣＭＢ，ＮＢＳ，ＴＮＢＳ，ＳＵＡＮ，ＢｒＡｃ及ＩＡｃ等化学修饰剂，选择修饰背角无齿蚌碱性磷酸酶的多种氨基酸残基，并测定其酶活力变化。结果表明，ＰＭＳＦ，ＮＢＳ，ＴＮＢＳ，ＳＵＡＮ和ＤＴＴ的修饰能显著抑制酶的活力，而且活力的降低程度与修饰剂的浓度相关。ＢｒＡｃ，ＩＡｃ和ＰＣＭＢ的修饰不表现对酶的抑制作用。初步认为，Ｓｅｒ，Ｌｙｓ和Ｔｒｐ残基是背角无齿蚌碱性磷     

缢蛏两种碱性磷酸酯酶与十二烷基磺酸锂作用过程中构象与活力变化的差异

碱性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase E.C.3,1.3.1.简称AKP)广泛存在于微生物界与动物界,它是催化水解磷酸单酯键,对物质代谢具有重要作用的水解酶。对它的研究已有很多报导。但对于软体动物中AKP的研究,国外报导极少,国内尚属空白。我可根据自己的工作从缢蛏软体动物门,瓣鳃纲,竹蛏科,(Sinonovacula constricata)中     

耐热碱性磷酸酯酶基因的DNA序列分析

从栖热菌中克隆到产耐热碱性磷酸酯酶（FD－TAP）基因并进行了DNA序列分析,结果表明此2．0kb的片段含有一个1056bp的开放阅读框,编码501个氨基酸的蛋白质,其N端有一26个氨基酸的信号肽．在起始密码子的上游5bp处有一个5＇－GGAGGT－3＇的SD序列．基因编码区的（G＋C）％为68．7％,第3位密码子（G＋C）％为92．7％．FD－TAP的氨基酸序列与大肠杆菌等生物的碱性磷酸酯酶氨基酸序列比较,相同性为27％,相似性为38％．中央β－折叠区及与活性中心相关的氨基酸残基高度保守．表明FD－TAP具有与大肠杆菌碱性磷酸酯酶相似的结构和作用机制．在相当于大肠杆菌碱性磷酸酯酶的His370至His412两个金属离子结合部位之间,FD－TAP有一72个氨基酸的插入片段,提示该插入片段与FD－TAP的高耐热性相关．     

耐热碱性性磷酸酯酶基因的DNA序列

从栖热菌中克隆到产耐热碱性磷酸酯酶基因并进行了ＤＮＡ序列分析。结果表明此２．０ｋｂ的片段含有一个１０５６ｂｐ的开放阅读框,编码５０１个氨基酸的蛋白质,其Ｎ端有一２６个氨基酸的信号肽。     

文昌鱼碱性磷酸酶功能基团的修饰与酶活力变化关系

用DEAE-Cellulose(DE-11)改进了酶的分离提纯方法,将酶提纯163倍,初步获得电泳均一的酶制剂。酶经光氧化后,活力迅速丧失,其失活过程按一级反应进行。酶经N-溴代琥珀酰亚胺作用后活力逐渐丧失。溴代乙酸在较高浓度下亦能抑制酶活力。酶经酰化后活力亦受抑制。实验结果初步表明:咪唑基吲哚基及氨基都是酶活力所必需的基因。     

文昌鱼碱性磷酸酶赖氨酸基团的研究

关于文昌鱼碱性磷酸酶(AKP)的基本性质及功能基团等,本实验室作了系统的研究,判定1个色氨酸残基为酶活性中心所必需,赖氨酸残基(Lys)是AKP活性必需基团之一,而每分子AKP上含有36个Lys。在此基础上,采用化学修饰剂对Lys基团进行定量研究,并探讨其它功能基团的性质,为酶的结构与功能关系提供进一步的信息。     

文昌鱼碱性磷酸酶的必需基团研究

对文昌鱼碱性磷酸酶的化学修饰研究结果表明:二硫键、赖氨酸残基和色氨酸残基与酶活性有关系。动力学方法测定酶活性基团的解离常数PK值为10.3,这数值与赖氨酸的ε-氨基的解离有关。活性基团的定量分析表明每个酶分子只有一个色氨酸残基是酶活性所必需的。     

耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的三维结构分析

有计算机图像模拟,能量极小化和分子动力学方法,以大肠杆菌碱性到酯酶（ＢＡＰ）为主要结构模板,构建了耐热碱性到酯酶（ＦＤ－ＴＡＰ）的三维结构,并分析了它的结构特征,从而为酶蛋白的结构、催化反应活性和热稳定性间关系的进一步研究打下了很好的基础。     

耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据耐热碱磷酸酯酶基因的酶切图谱和ＤＮＡ序列,分别在基因的起始密友子和终止密码子设计２个突变引物。引物的５‘端分别带有ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切全点。通过ＰＣＲ从质粒ｐＴＡＰ１１８Ｂ中扩增获得了ＦＤ－ＴＡＰ基因的全序列。经过酶切将基因亚克隆于高达载体ｐＪＬＡ５０３。     

缢蛏碱性磷酸酶胍变性中构象与活力变化的研究

缢蛏(Sinonovacula constricta)是一种海产重要经济贝类。本文报告从缢蛏中提取了分子量为420,000和130,000二种不同形式的碱性磷酸酶(简称APKⅠ和AKPⅡ),经不同浓度盐酸胍处理时酶的变性与失活的动力学过程。以荧光光谱为监测手段,测得AKPⅠ和AKPⅡ在0.5M、2.0、M、4.0M胍中的变性速度常数分别为0.0030秒~(-1)、0.0064秒~(-1)、0.0100秒~(-1)和0.0050秒~(-1)、0.0065秒~(-1)、0.0092秒~(-1);在0.5M胍中,AKPⅠ和AKPⅡ均保持100％的剩余活力;在2.0M胍中,AKPⅠ和AKPⅡ的失活均为快和慢二个一级的的过程,其失活速度常数分别为0.0025秒~(-1)(快)、0.00068秒~(-1)(慢)和0.0021秒~(-1)(快)、0.00041秒~(-1)(慢)。在4.0M胍中,AKPⅠ和AKPⅡ的活力完全丧失。本文中就这些结果进行了讨论。     

介孔分子筛HMS上碱性基团功能化的条件探索

介孔分子筛材料的合成和应用已经引起了国内外的普遍注意 ,其中一些已被用作催化剂[1] 及催化剂载体[2 ,3] .介孔分子筛由于具有宽大的孔道和大量的表面ＳｉＯＨ ,故与传统的微孔分子筛相比 ,在通过表面功能化引入催化活性中心方面有着独特的优势 .这已成为近几年来分子筛领域的研究热点[4,5 ] .然而 ,功能化条件对样品性质的影响还未见详细报导 .本文通过表面硅烷化反应在介孔分子筛ＨＭＳ上共价锚接了碱性基团 (氨基和乙二胺基 ) ,考察了功能化反应条件以及孔道大小和不同功能分子对功能基团负载量的影响 .用十二胺 (ＤＤＡ)或十八胺 (Ｏ…     

耐热碱性磷酸酯酶(TAPND27)的表达、纯化和性质测定

通过分离纯化和酶学性质测定,确定耐热碱性磷酸酯酶（ＴＡＰＮＤ２７）为八聚体,最适反应温度为６５℃,在９９℃保温３０ｍｉｎ仍保留４９．４％的活性,在质量分数为５％的Ｔｗｅｅｎ２０体系中依然有７０％以上的酶活性,并且有很宽的ｐＨ稳定范围。这表明ＴＡＰＮＤ２７适合在高温条件和高浓度去污剂的体系中应用。     

中华猕猴桃蛋白酶催化功能基团的研究

从野生中华猕猴桃分离提纯得SDS电泳单一纯酶制剂,酶蛋白的总巯基数为7,其中游离巯基数为1.3×10~(-5)MpCMB使酶活力丧失100％,酶修饰失活呈一级反应,表明酶分子的唯一游离巯基为该酶催化活性的必需功能基团.酶在2×10~(-4)M PMSF,活力仍不受影响,提示Ser残基与酶的催化功能无关.以Na_2S_4O_6保护游离巯基,用NBS修饰Trp残基,并辅以紫外光谱和萤光光谱分析.结果表明Trp残基为酶催化功能所必需.初步的CDC化学修饰结果亦表明,羧基似与酶催化活性有关.     

果菠萝蛋白酶催化功能基团的研究

以菠萝果为材料,应用本实验室开发的工业生产法工艺制备粗酶制品,进一步经DEAE-纤维索(DE-52)和 Sephadex G-75柱层析纯化,获得圆盘电泳单一纯的果酶制剂,测定酶的分子量为29 800,含 19种不同氨基酸,总残基数为286个。化学修饰研究结果表明:巯基、氨基、Trp残基和唯一的His残基是酶活性必需基团,而Ser和羧基与酶活性无关。用邹氏作图法判断 Trp残基的必需基团数,表明酶分子中六个Trp残基仅有一个是酶活性所必需的。     

福寿螺β-葡萄糖苷酶催化功能基团

应用化学修饰法研究福寿螺β－葡萄糖苷酶活性功能基团的性质．用５，５′－二硫代双（２－硝基苯甲酸）和对－氯汞苯甲酸为修饰剂修饰酶分子中的巯基，酶活力基本不受影响，说明该酶不是“巯基酶”．用Ｎ－溴代琥珀酰亚胺在ｐＨ６．０下修饰酶后，可使酶活力完全丧失，被修饰后的酶分子在２７８ｎｍ处的紫外吸收峰逐渐下降至完全消失，３３８ｎｍ处的荧光发射峰也逐渐下降至完全淬灭，说明色氨酸残基是酶活性必需基团之一．用碳二亚胺、溴代乙酸或甲醛修饰酶，可以使酶活力完全丧失，说明羧基、组氨酸的咪唑基及赖氨酸的氨基也与酶活性有密切的关系．用乙酰丙酮、苯甲磺酰氟修饰酶，酶活力不受影响，表明精氨酸残基和羟基与酶活性无关．