蓝藻基因表达载体系统的构建和应用

蓝藻是一类具植物型放氧光合作物特性的原核生物。多数蓝藻富含营养物质,无毒,是表达外源目的基因的独特受体系统。因此,构建适用于蓝藻表达外源目的基因的载体系统,并用于表达药物活性肽基因,已成为当前蓝藻基因工程研究的热点之一。本课题组10多年来率先在国内开展蓝藻基因工程研究,从蓝藻Plectonema botyanum中分离得到了约1.5kb的小质粒,以此为出发质粒,构建了蓝藻穿梭质粒pPRS-1和穿梭质粒表达载体pPKE2;同时根据DNA片段同源重组的性质,构建了蓝藻Calothrix sp.PCC7601、Synechococcus sp.PCC7942的基因整合平台系统。在国家863项目经费资助下,利用构建的蓝藻质粒载体和基因整合平台系统,把人源胸腺素基因转入蓝藻Calothrix sp.PCC7601和Synechoccus sp.PCC7942,并能高效表达,首次获得了可直接口服的含人源胸腺素的转基因蓝藻,这对研究和开发基因工程口服药物具有重大的科学意义和经济、社会效益。     

核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制 …

设计切割烟草花叶病毒ＲＮＡ的锤头型核酶Ｒｚ－２，分别以ｐＫｙＬｘ７和ｐＢｉｎ１９为载体，构建含Ｒｚ－２基因及核酶和底物连接的ＲｚＳｂ－２基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ｔｉ质粒。     

HER-2基因特异性核酶设计与体外转录载体构建

目的 构建人表皮生长因子受体-2(HER-2)特异性核酶(ribozyme,RZ)及其底物基因的体外转录载体.方法 设计合成RZ基因,将该RZ克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,测序鉴定.应用Trizol试剂提取MDA-MB-453细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因HER-2 cDNA片段,同样插入载体pcDNA3.1( ),测序鉴定.结果 经DNA测序分别证实合成的RZ基因序列和通过RT-PCR扩增的HER-2 cDNA序列克隆入pcDNA3.1( )中.结论 构建HER-2特异性RZ真核表达载体及含有HER-2 cDNA的载体,有助于进一步研究RZ对靶基因切割作用及雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER-2信号转导通路.     

核酶的发现及其在基因治疗中的应用

核酶是具有催化功能的结构性RNA分子,且大多数核酶具有剪切RNAs的功能,可以利用它们剪切信使RNA(mRNAs)调节基因表达,从而作为基因治疗的新手段.阐述核酶的发现历程,以及其在艾滋病、肝炎、肿瘤和生殖道系统感染等基因治疗的研究进展.最后,分析核酶在基因治疗中的技术优势及存在问题,并对核酶领域包括更多核酶晶体结构的确立、酶切机理的理解、核酶新的生物学功能的发现等研究进行展望.     

番茄ACC合成酶基因的反义RNA—核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转

将克隆的番茄ACC合成酶基因的反义RNA－核酶联合的DNA序列用Hind Ⅲt KpnI切割后重组于植物表达载体pGA643中,用三亲融全导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化茄子叶,诱导出再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株。提取植物总DNA,用pGA643作探针,通过斑点杂交,已筛选出整合有外源基因的工程植株。为进一步研究该嵌合基因对ACC合成酶基因表达的影响及获得商品化的转基因番茄奠定了基础。     

桥序列在构建人工核酶M1GS中的作用

目的：为检验连接的Gs序列是否会影响M1RNA高级结构而导致M1RNA活性改变,对核酶的催化机制进行探讨。方法：通过软件模拟对M1GS进行结构分析,筛选了一段独立折叠的桥序列连接M1RNA与GS,并通过体外切割实验检验有桥和无桥序列的核酶的活性。结果：有桥序列的M1GS具备体外特异切割底物的核酶活性,而无桥序列的M1GS核酶未表现体外切割活性。结论：证实桥序列对维持M1RNA高级结构和保持人工核酶M1GS的体外切割活性具有重要作用。     

壳寡糖纳米载体细胞内递送EGFR脱氧核酶的研究

设计靶向EGFR mRNA的脱氧核酶(EGFR DRz),以壳寡糖(COS)为材料,建立了一种有效的纳米基因细胞内传递体系,并研究其介导的靶向EGFR的脱氧核酶在Hela细胞内的生物学效应.流式结果表明COS-EGFR DRz复合体转染效率为88.7%,与脂质体转染试剂的89.7%相比无显著差异.半定量RT-PCR结果显示,经壳寡糖纳米载体递送的EGFR DRz能有效地靶向切割Hela细胞内的EGFR mRNA,使其表达下降.进一步的流式分析显示细胞被阻滞在G0～G1期,并且出现凋亡现象,其中COS组的凋亡率为19.3%,大于对照组脂质体的凋亡率13.0%.研究表明,COS较脂质体有相似的转染效率和更低的毒性,是一种潜在的、有效的脱氧核酶递送载体.     

逆转录病毒载体设计对ANTI—RAS核酶基因转移效率的影响

将ａｎｔｉ－ｒａｓ核酶基因Ｒ８克隆于不同的逆转录病毒载体，并导入逆转录病毒包装细胞质ＰＡ３１７，得到具一次感染性的缺失性病毒，通过测定病毒滴度选择Ｒ８基因的高效重组转录病毒载体。     

人端粒酶逆转录酶核酶抑制端粒酶活性的实验研究

为有效切割端粒酶逆转录酶mRNA为抑制端粒酶活性,设计合成了针对端粒酶逆转录酶mRNA的核酶基因htert RZ及htert-5'RZ,构建了核酶基因的体外转录和真核表达质粒,将核酶转染至肿瘤细胞中,均能抑制端酶活性,核酶heterRZ稳定转染细胞后,使细胞倍增时间长,但无明显细胞凋亡,因而,二种核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂,用于抑制肿瘤生长。     

TaNHX2基因植物表达载体的构建及在烟草中的表达

将TaNHX2基因重组于质粒pBIN438的CaMV 35S启动子下游,构建含TaNHX2基因的植物双元表达载体pBIN438-TaNHX2.采用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tobacum L.),获得含TaNHX2的转基因烟草植株.经PCR、RT-PCR分析表明,TaNHX2基因已整合到烟草中,并且得到表达.耐盐分析表明,外源基因TaNHX2提高了转基因植株的耐盐性.     

小鼠IL—6基因的克隆及表达载体的构建

采用常规的分子生物学技术,从小鼠骨髓细胞中克隆了含信号肽序列的IL－6,并构建了表达载体,序列分析表明所克隆的IL－6序列与献已报道的一致,构建的表达载体经鉴定正确。     

HIV与核酶的基因治疗策略

HIV是引起AIDS的病原 ,文章概述了HIV的形态结构、致病性及使用核酶进行基因治疗的策略     

抗冻肽基因在热激表达盒式载体中的构建

克隆于细菌表达载体ｐ＾ＧＥＭ－３ｘｆ（－）中的ＡＦＰ基因经ＳａｌＩ和ＫｐｎＩＩ消化后，插入到热激盒式表达载体ｐ＾ＭＡ４１２的ＳａｌＩ和ＫｐｎＩ位点中，连接于可融合的报道基因元。     

合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体

利用反义 RNA和核酶进行基因表达调控是当今植物分子生物学的研究热点之一 .但在转基因植物中 ,利用 RNA聚合酶 型启动区表达效率不高 .番茄 U3sn RNA基因由 RNA聚合酶 来转录 ,具有较高的转录效率 ,为一般转录效率的 1 0 0～ 1 0 0 0倍 .我们人工合成了番茄 U3sn RNA基因上游启动区 ( 1 5 2 bp) ,构建到番茄 ACC合成酶的反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列的上游 ,然后将“启动区 -反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列”插入到植物双元表达载体p GA6 4 3中 ,并用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,为研究 U 3sn RNA上游启动区增强反义 RNA-核酶基因的表达奠定了基础     

脱水蛋白DHN1表达载体pBV221-dhn1的构建及基因表达

以克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )为基础 ,构建脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.采用PCR技术从克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )上扩增dhn1片段 ,并引入NcoⅠ /BamHⅠ酶切位点 ,然后与 pBV2 2 1原核表达载体连接 ,得到 pBV2 2 1 dhn1表达载体 .阳性克隆经PCR和NcoⅠ /BamHⅠ酶切检测都得到 516bp的dhn1片段 ,且序列正确 .表达载体pBV2 2 1 dhn1转化宿主菌后能够表达产生相对分子质量为 2 2× 10 3的DHN1,该蛋白具有高温可溶性 .以上结果表明 ,本实验得到了高效表达的脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.     

端粒酶核酶抑制肿瘤细胞生长的研究

已证明有84.7%的人类恶性肿瘤组织细胞中端粒酶表达异常增高.端粒酶的作用是合成染色体末端端粒重复序列维持染色体稳定及细胞永生化的关键因素.因此,端粒酶在肿瘤发生发展中起重要作用,是目前最广泛的肿瘤标志物.核酶是一种具有内切酶活性的RNA分子,只要满足一定的空间结构就能定点切割RNA底物.切割端粒酶的核酶(简称为端粒酶核酶)主要针对端粒酶的两个亚单位hTR和hTERT抑制两基因的表达,降低端粒酶的活性,抑制肿瘤细胞的生长.     

AML1-ETO基因表达质粒的构建

t(8；21)染色体易位是导致急性髓系白血病的最常见的发病机制，AMLl-ETO是t(8；21)易位所产生的融合基因．为了研究在细胞中能与AMLl-ETO相互作用的蛋白质，利用PCR、酶切、连接、转化、提质粒等分子生物学技术，首先将该基因构建于质粒中，然后转染大肠杆菌，并在大肠杆菌中得到扩增，为进一步深入研究打下基础，本次实验所构建的质粒经测序表明，AMLl-ETO融合基因以正确的阅读框重组转染入载体，并在大肠杆菌中得到扩增．     

逆转录病毒载体介导的Anti-ras核酶对T24ras转化3T3细胞的抑制作用

突变ｒａｓ基因存在于多种人类肿瘤细胞中,本文将可特异性切割１２位点突变ｒａｓ（Ｔ２４ｒａｓ）之核酶Ｒ８通过逆转录病毒载体导入Ｔ２４ｒａｓ转化的ＮＩＨ３Ｔ３细胞,以期检测核酶在细胞内对其靶基因的作用．结果表明Ｒ８可特异性地切割突变ｒａｓｍＲＮＡ,导致转化细胞生物学特性如细胞形态、生长速度等在一定程度上发生逆转     

脱氧核酶在基因治疗上的应用

长期以来,DNA一直被认为是一种被动分子,仅仅适合于携带遗传信息.但通过体外筛选技术得到脱氧核酶后,发现DNA作为具有催化活性的核酸,理论上能够对任意序列的 RNA分子进行特异性切割,因此具有潜在的治疗应用价值.