牦牛α-乳清蛋白基因5''''-非翻译区部分序列测定及PCR-RFLP分析

用PCR方法扩增了麦洼牦牛α-乳清蛋白基因5'-非翻译区的部分序列.该序列与普通牛的相应序列具有很高的同源性(98.1%),但存在8个碱基差异,碱基突变类型包括1个缺失,5个转换和2个颠换.应用PCR-RFLP方法分析了麦洼牦牛和九龙牦牛α-乳清蛋白基因-1689位单碱基的多态性,结果在该位点没有检测到多态性.     

麦洼牺牲占和犏牛乳蛋白的遗传多态性

用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了５４头麦洼牦牛和１９头牦牛乳蛋白的遗传多态性。结果显示，牦牛和犏牛的α－乳清蛋白均呈ＢＢ型，β－乳球蛋白在犏牛中为ＡＢ型，在牦牛中型β－乳球蛋白在凝胶上梁色通常极弱。     

麦洼牦牛和九龙牦牛FSHβ基因的PCR-SSCP分析

运用一对特异性引物对麦洼牦牛、九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区进行了扩增,应用PCR-SSCP方法对其进行了多态性分析.结果表明:在麦洼牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区有AA型、AB型和BB型三种基因型,九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区只检测到了AA型、AB型两种基因型.在两种牦牛品系中,AA基因型频率最高,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率.麦洼牦牛和九龙牦牛群体中多态信息含量分别为0.3431、0.1411,麦洼牦牛多态性能高,遗传变异大.     

牦牛DIO2基因克隆及其在骨骼肌的表达分析

为探索DIO2基因调控牦牛骨骼肌发育及肌纤维类型组成的潜在功能,克隆DIO2基因CDS序列并进行相关的生物信息学分析,以及比较分析其在牦牛骨骼肌的差异表达.结果显示,DIO2基因的CDS全长为789 bp,编码132个氨基酸.序列同源性比对及系统进化树分析发现,牦牛DIO2基因与普通牛的亲缘关系最近,核酸及蛋白序列与普通牛一致;与小鼠的亲缘关系较远,序列同源性仅为86.75%和87.12%,与原鸡的亲缘关系最远,二者的同源性分别为79.17%和76.30%.理化性质预测表明DIO2蛋白为不稳定疏水性蛋白,有跨膜结构域,具有24个磷酸化位点,蛋白结构为无规则卷曲、α-螺旋和延伸链三者交替出现.采用实时荧光定量PCR分析显示,DIO2基因在牦牛的脾、肺等内脏组织表达无显著差异;在背最长肌和半腱肌的表达量显著高于脂肪和肝脏组织(P0.01).此外,DIO2在金川牦牛半腱肌的表达量显著高于麦洼牦牛(P0.05).以上结果为研究DIO2在牦牛骨骼肌的功能提供参考资料.     

麦洼牦牛血液蛋白多态性的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对麦洼牦牛９个血液蛋白基因座（Ｈｂ、Ｔｆ、ＰＴｆ、Ａｋｐ、ＬＤＨ－１、Ａｌｂ、Ａｍｙ、Ｈｐ、Ｐａ）进行检测,并计算其基因频率和基因型频率．结果表明,在检测的９个基因座中４个基因座（Ｔｆ、ｐＴｆ、Ａｋｐ、ＬＤＨ－１）具有多态性,麦洼牦牛群体遗传变异程度低     

用高效液相色谱法比较牦牛和犏牛乳中两种乳清蛋白含量

为比较牦牛和犏牛乳中两种乳清蛋白的含量,采用C18柱建立了检测牦牛乳和犏牛乳中α-乳清蛋白(α-La)和β-乳球蛋白(β-Lg)含量的高效液相色谱法(HPLC).试验动物包括放牧全奶麦洼牦牛(n=40)、半奶麦洼牦牛(n=27)和犏牛(n=36),分别从其全乳中制备乳清后,用HPLC方法测定两种乳清蛋白含量.结果表明,全奶牦牛、半奶牦牛和犏牛乳中α-La平均含量接近,约为0.86 mg/mL;β-Lg含量分别约为7.10 mg/mL、9.64 mg/mL和6.96 mg/mL,在半奶牦牛乳中含量极显著高于全奶牦牛乳和犏牛乳(P<0.01),而在全奶牦牛乳和犏牛乳中的含量接近.β-Lg的色谱图为单峰或双峰,未见明确规律.进一步用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)对牦牛乳和犏牛乳中β-Lg进行基因分型,表明牦牛中均为EE型,犏牛中为AE和BE型,BE型频率为0.694 4.HPLC可以分析牦牛和犏牛乳中α-La和β-Lg含量,但无法对β-Lg进行基因分型.     

牦牛GPRIN3基因的克隆及组织表达分析

为探索GPRIN3基因的生物学特性,以麦洼牦牛为试验材料,利用RT-PCR技术扩增GPRIN3基因编码区序列并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测GPRIN3在牦牛不同组织的mRNA表达水平.结果表明,克隆得到GPRIN3基因编码区序列大小为2 343 bp,编码780个氨基酸残基;麦洼牦牛与野牦牛氨基酸序列相比,一致性为99.62%,共有3个位点发生突变,分别是103(G→R)、366(T→M)、404(E→K).系统进化分析显示,牦牛与野牦牛亲缘关系最近,其次是普通牛,与黑猩猩的亲缘关系最远;含有GRIN-C超家族保守功能结构域;实时荧光定量PCR结果表明,GPRIN3在麦洼牦牛肺脏组织中表达量最高,其次是肝脏,在臀肌中表达量最低.本研究为进一步探讨牦牛GPRIN3基因及其编码蛋白的结构和功能提供理论基础,为牦牛分子育种提供新思路.     

牦牛乳上皮粘蛋白MUC1的遗传多态性研究

采用凝胶电泳方法分离牦牛乳上皮粘蛋白MUC1，通过比较乳MUC1的多态性发现麦洼牦牛、九龙牦牛、天祝白牦牛、青海牦牛和西藏牦牛共5个牦牛群427头泌乳牦牛乳MUC1存在9种MUC1类型，蛋白质分子质量范围为163—208ku，普遍大于普通乳牛；群体遗传变异分析表明牦牛乳MUC1的基因频率、基因型频率存在品种间差异，基因杂合度较大，根据乳MUC1基因频率可将5个牦牛品种明显地聚为两类，提示牦牛乳MUC1存在地方类群的特异性.     

牦牛乳经凝乳酶作用后的蛋白组分变化

为研究牦牛乳经凝乳酶凝乳后的乳蛋白组分变化,在牦牛乳中加入凝乳酶进行凝乳,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和碱性尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,对凝乳酪蛋白和乳清蛋白的组成进行了分析.结果显示,牦牛乳凝乳后酪蛋白发生了显著水解,水解产物存在于凝乳酪蛋白中,同时乳清中新增加了一些低分子量的可溶性蛋白.这些变化可能涉及部分α-酪蛋白的水解.     

青海牦牛乳蛋白的多态性和基因分化

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法对 2 0 1头青海牦牛四种乳蛋白的多态性及其基因分化进行了研究。结果发现 :①α -LA和αsl-CN基因座存在多态性 ,乳蛋白的多态性基因座比例为 5 0 % ;②αsl-CN基因座受αsl-CNB,αsl-CNC 和αsl-CNE 三个复等位基因控制 ,其基因频率分别为 0 0 896,0 631 8和 0 2 786;③青海牦牛四种乳蛋白的平均有效等位基因数为 1 1 495个 ,平均基因杂合度为 0 1 30 0 4 ,平均基因纯合度指数为 0 80 4 3;④环湖型牦牛与高原型牦牛乳蛋白的多态性特征相似 ,两者之间的遗传距离很小 ( 5 36× 1 0 -5) ,基因分化程度低 ( 0 484% )。     

麦洼牦牛和犏牛乳蛋白的遗传多态性

用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了５４头麦洼牦牛和１９头犏牛乳蛋白的遗传多态性．结果显示，牦牛和犏牛的α乳清蛋白均呈ＢＢ型．β乳球蛋白在犏牛中为ＡＢ型，在牦牛中Ａ型β乳球蛋白（βＬｇ）在凝胶上染色通常极弱．另外，在７头处于干乳期犏牛的乳腺分泌物中，有５头其Ａ型βＬｇ的电泳迁移率显著快于其它犏牛的Ａ型βＬｇ，而其Ｂ型βＬｇ则慢于牦牛和其它犏牛的Ｂ型βＬｇ．牦牛和犏牛的β酪蛋白以Ａ１Ａ１型为主，αｓ１酪蛋白以ＢＢ型为主．试验还观察到犏牛的Ａ型αｓ１酪蛋白电泳迁移率快于牦牛的Ａ型αｓ１酪蛋白     

八肋游仆虫一个新β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

从八肋游仆虫细胞中克隆到一种新的β-微管蛋白基因.序列分析结果表明:在大核中,该基因全长1561bp.与已经报道过的β-微管蛋白基因不同,它的5′端基因上游调控序列有49 bp,AT含量为75.5%.上游调控序列中仅有一个TATAA框,没有CCAAT框;该基因的3′端的下游调控序列有121 bp,富含AT碱基,达到86.8%,其中有明显的反向重复序列.上下游调控序列中各有一个断裂信号TTGAA和TTCAA,负责从小核到大核发育过程中大核染色体的形成.从小核基因组中克隆到相应的基因片段,比大核中的序列多7个碱基5′-CATGCTC-3′,其功能尚不清楚.序列比对表明,新的β-微管蛋白基因与已经报道的β-微管蛋白基因的同源性92.3%,阅读框中有2个氨基酸的变化,将它命名为β2-微管蛋白基因.     

九龙牦牛和麦洼牦牛血清酯酶、淀粉酶同工酶遗传特性及其与生产性能相关的研究

采用非连续性缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分别对50头九龙牦牛和50头麦洼牦牛的血清酯酶(ES)同工酶、淀粉酶(Am)同工酶进行了研究。在ES同工酶的研究中,九龙牦牛5带较多,占43.9％,麦洼牦牛6带较多,占54.7％;九龙牦牛的带型座含有Es—5,而麦洼牦牛有Es—8,却无Es—5;Am基因座均受Am~A、Am~B、Am~C三个等显性等位基因控制,两个品种都未出现AA和AB型,且Am~c基因频率是两个品种的优势基因;麦洼牦牛的杂合子频率(0.867)高于九龙牦牛(0.780)。表明麦洼牦牛的遗传特性比九龙牦牛复杂。对麦洼牦牛的两个同工酶的活力与产奶量、乳脂率以及体重的关系作了相关分析,结果表明ES同工酶的强带与产奶量、乳脂率呈显著正相关、与体重呈显著负相关。Am同工酶的总活力与产奶量、乳脂率呈显著的负相关、与体重呈显著正相关。这不仅表明了ES同工酶、Am同工酶与生产性能具有较密切关系,而且对开展选育工作及牦牛生产性能鉴定等方面有重要意义。     

昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段多态性的快速检测

分析昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段多态性.用Chelex-100方法从昌台牦牛(n=100)全乳中提取基因组DNA,利用PCR对κ-酪蛋白基因第四外显子部分片段进行扩增,通过非变性PAGE及银染确定κ-酪蛋白基因重复片段多态性.结果显示昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段存在A和B两种等位基因,基因频率分别为0.094,0.906,B等位基因包含12 bp的重复片段.AB型个体17个,BB型个体73个.昌台牦牛κ-CN基因重复片段等位基因B为优势等位基因.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.     

新麦26的α-醇溶蛋白基因克隆与序列分析

α-醇溶蛋白是小麦籽粒中含量最为丰富的蛋白，也是诱发乳糜泻综合症(celiac disease, CD)的主要活性蛋白.为了解优质强筋小麦新麦26(Triticum aestivum L.)的α-醇溶蛋白基因构成和诱发CD的毒性肽段，作者采用AS-PCR方法从新麦26中克隆了63个序列长度为846-942 bp的全长基因，其中30个序列为假基因，33个序列为功能基因，暂定名为XMGli2-1-XMGli2-33.上述基因可编码长度为285-316个氨基酸的蛋白序列，这些序列具有典型的α-醇溶蛋白特征.其中XMGli2-10、XMGli2-19、XMGli2-26、XMGli2-32和XMGli2-33的多聚谷氨酰胺II区还出现了1个额外的半胱氨酸残基，有助于参与形成链间二硫键，与小麦面筋品质呈正效应.在4类诱发CD的毒性肽段中，DQ2.5-glia-α1a的保守性更强，其他毒性肽段的序列变化较大.在XMGli2-20和XMGli2-28中还存在一个LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQ的肽段，具有较强的免疫毒性.     

牦牛和黄牛睾丸组织Prdm9基因cDNA序列的比较

为比较牦牛与普通牛Prdm9基因的序列特征,采用RT-PCR和3’-RACE方法,从牦牛和黄牛睾丸组织总RNA中分别获得Prdm9基因的部分cDNA序列,经过拼接后获得了牦牛和黄牛Prdm9基因的完整cDNA序列,长度分别为2580bp和2421bp,编码序列长度均为2091bp,共编码696个氨基酸,氨基酸序列相似性为98.56%.分析显示,牦牛和黄牛Prdm9基因开放阅读框有10个核苷酸同义突变和10个单核苷酸多态性(SNPs),并导致10个氨基酸差异,其中4个位于锌指域.研究结果表明,牦牛和黄牛Prdm9基因结构特征类似,但在锌指域存在一些氨基酸差异,可能会影响该基因的功能.     

牛α-乳清蛋白基因5′端非编码区单碱基多态性

综述了牛α－乳清蛋白的来源、功能及其基因非编码区单碱基多态性，并讨论了牛α－乳清蛋白基因非编码区（＋１５）单碱基多态性同泌乳性能的相关性     

牛亚科3个主要家养牛种MyoG基因多态性及其遗传分化

对普通牛(鲁西牛、渤海黑牛)、天祝牦牛和中国广西水牛的MyoG基因部分核苷酸序列变异进行了分析,旨在揭示不同牛种群的DNA多态性及其遗传分化.采用PCR和DNA直接测序技术获得4个牛群体的MyoG基因exon 1和5’侧翼部分序列,与GenBanK公布的牛亚科动物同源序列作比对分析.结果显示,在渤海黑牛和牦牛未发现多态位点;鲁西牛存在1个多态位点,定义了2个单倍型;水牛有6个突变位点,但群内只发现1个多态位点.核苷核苷酸多样性(Pi)在0.000 00～0.001 35之间,说明群体内遗传多态性程度较低。核苷酸歧义度(Dxy)以水牛与鲁西牛之间比较最高,为0.013 97,表明水牛遗传分化明显.种系进化树分析表明,牦牛与普通牛亲缘关系很近,二者与水牛关系较远,支持将牦牛归为牛属(Bos)的一个亚属或一个种的观点.     

牛乳主要过敏原α-乳白蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

采用RT-PCR技术克隆牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的全长基因,并根据序列设计带有酶切位点的特异性引物对所得cDNA的开放阅读框进行扩增,将所得基因片段克隆到PET-28a载体.结果克隆了牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的完整基因,所克隆的基因开放阅读框全长为429 bp,编码142个氨基酸,该蛋白相对分子质量约为16 265,等电点为6.10,与理论值相符.通过与Genbank中已有序列比对分析,同源性高达100%.实现构建该基因的PET-28a原核表达载体,为牛乳主要过敏原α-乳白蛋白基因的相关研究奠定了基础.