黄犏牛与黄牛b-Boule基因编码区序列、结构、表达模式和睾丸组织表达水平的差异分析

Boule是动物精母细胞减数分裂过程中的必需蛋白,与精子发生减数分裂阻滞、雄性不育等密切相关.文中通过PCR扩增和克隆测序获得黄犏牛b-Boule基因的cDNA全序列,生物信息学分析发现黄犏牛b-Boule基因编码区全长885 bp,具有典型的RNA识别基序(RRM)和DAZ重复序列;与黄牛氨基酸序列的同源性为98.65%,仅在C-末端有4个氨基酸的差异,典型结构域的氨基酸序列和高级结构相同.RT-PCR发现b-Boule基因在黄牛和黄犏牛睾丸组织中特异表达,原位杂交显示b-Boule存在于初级精母细胞和次级精母细胞的细胞质中.荧光定量PCR发现黄牛睾丸组织中b-Boule基因表达水平显著高于黄犏牛(P<0.05),且黄犏牛精子发生减数分裂阻滞的表型与人、小鼠BDule基因表达缺失或降低引起的不育表型一致,因此推测b-Boule基因可能在精母细胞减数分裂过程中发挥重要作用,且与黄犏牛雄性不育有密切的关系.     

在单细胞水平建立原位PCR基因鉴别技术平台——以精子基因型鉴别为例

目的精子发生是一个包括有丝分裂和减数分裂的精细调控过程,这一过程是从精原干细胞开始在雄性睾丸的曲细精管中完成的,由哺乳动物雌雄性比例接近1∶1这一现象可以推知:受精时带X基因的精子和带Y基因的精子比率应该是1∶1,但事实上精子发生的过程中,分化出来的X、Y精子的比例是否也为1∶1并不清楚,因为精子发生过程中并不是所有细胞都能最终形成精子,然而要研究雌雄出生比率就需要先研究精子本身是否严格地按照1∶1形成,因此本实验通过建立快速可靠原位PCR技术平台为进一步研究精子发生的调控过程提供支持。步骤用HSL基因优化荧光原位PCR实验方案,包括蛋白酶K作用时间和浓度,原位PCR前先对精子进行解聚,再用SRY基因对精子进行原位PCR鉴定。结果在荧光显微镜下可清楚地看到精子头部的荧光信号,头部有绿色荧光信号的精子为带有SRY基因的Y染色体精子(Y精子),实验检测到昆明小鼠精子共493个,有信号的共273个,X∶Y=55.37%,经卡方检验,X精子与Y精子的实验结果趋近于1∶1。结论可利用荧光原位PCR技术在单细胞水平快速鉴定精子"性别",理论上可用于任何细胞的任何基因的鉴定。     

牛精子发生相关新基因b-DAZL的克隆、生物信息学分析与组织表达研究

人和多种动物的DAZL(Deleted in AZoosPermia-like)基因是精子发生的重要调控因子,DAZL基因突变或表达缺乏将导致精子发生过程减数分裂障碍和雄性不育.文中采用电子克隆和克隆测序方法获得了黄牛DAZL,基因cDNA全序列,利用生物信息学方法进行黄牛DAZL基因序列和蛋白结构分析,并对黄牛、牦牛和犏牛DAZL基因的组织表达特征进行了分析.结果发现黄牛DAZL,基因cDNA全长2509 bp,编码295个氨基酸(命名为b-DAZL);b-DAZL基因含有12个外显子和11个内含子,定位于牛1号染色体末端;b-DAZL基因与哺乳纲各物种同功能基因开放阅读框的同源性为90%一94%,其编码蛋白含有DAZL典型的RNA识别基序(RRM),DAZ重复基序,Pumilio一2和PABP作用位点.RT-PCR结果显示b-DAZL,基因仅在成年黄牛和成年牦牛睾丸、卵巢组织中表达,在成年F1代犏牛的卵巢组织中表达而在睾丸组织中检测不到表达信号,且犏牛睾丸组织切片表现出DAZL,基因缺失的典型精子发生障碍表型,因此推测b-DAZL基因在牛精子发生过程中发挥重要作用,可能与F1代犏牛雄性不育相关,是犏牛雄性不育的候选基因.     

牛精子发生相关新基因b-DAZL的克隆、生物信息学分析与组织表达研究

人和多种动物的DAZL(Deleted in AZoospermia-like)基因是精子发生的重要调控因子,DAZL基因突变或表达缺乏将导致精子发生过程减数分裂障碍和雄性不育.文中采用电子克隆和克隆测序方法获得了黄牛DAZL基因cDNA全序列,利用生物信息学方法进行黄牛DAZL基因序列和蛋白结构分析,并对黄牛、牦牛和犏牛DAZL基因的组织表达特征进行了分析.结果发现：黄牛DAZL基因cDNA全长2509bp,编码295个氨基酸(命名为b-DAZL);b-DAZL基因含有12个外显子和11个内含子,定位于牛1号染色体末端;b-DAZL基因与哺乳纲各物种同功能基因开放阅读框的同源性为90%—94%,其编码蛋白含有DAZL典型的RNA识别基序（RRM）,DAZ 重复基序,Pumilio-2 和PABP 作用位点.RT-PCR结果显示：b-DAZL基因仅在成年黄牛和成年牦牛睾丸、卵巢组织中表达,在成年F1代犏牛的卵巢组织中表达而在睾丸组织中检测不到表达信号,且犏牛睾丸组织切片表现出DAZL基因缺失的典型精子发生障碍表型,因此推测b-DAZL基因在牛精子发生过程中发挥重要作用,可能与F1代犏牛雄性不育相关,是犏牛雄性不育的候选基因.     

Quox—1基因同源序列在豚鼠精子形成中的表达

以地高辛标记的Ｑｕｏｘ－１基因ｃＤＮＡ的ｃ３片段为探针，与豚鼠基因组ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果表明，在豚鼠基因组中存在Ｑｕｏｘ－１基因同源序列，以抗ＱＵＯＸ－１蛋白的特异性抗体对成年豚鼠睾丸，附睾和幼年豚鼠睾丸的组织切片进行免疫组织化学分析，发现在豚鼠精子发生中精子细胞分化为精子阶段有类ＱＵＯＸ－１蛋白提示Ｑｕｏｘ－１基因同源序列可能对豚鼠精子发生中的精子形成过程有调控作用。     

蟋蟀雄性生殖系统的结构和精子发生

研究了蟋蟀雄性生殖系统的结构和精子发生的动态过程 .成熟的雄性生殖系统主要由一对精巢 ,一对输精管 ,一对附腺 ,一对储精囊和一根射精管组成 .精巢乳白色由许多精巢管盘曲组成 ,精巢管包括原精区、生长区、成熟区和变形区四个区域 .其主要特点是处于不同发育时期的精母细胞呈放射状密集排列在圆球形的育精囊中 .精子发生的动态是 :一龄期 ,精巢小管仅具一些精原细胞 ;二～三龄期 ,精原细胞不断通过有丝分裂增殖 ;四龄期 ,初级精母细胞形成 ,并由减数分裂形成次级精母细胞 ;五龄期 ,精细胞大量形成 ,并变形成为精子 .其主要特点是成虫期的精巢管中存在所有各期生殖细胞 ,当下端的精子成熟时 ,上端部分的精母细胞再发育形成精子 ,表明从五龄开始蟋蟀便能连续不断地产生精子     

剑尾鱼精巢的显微和超微结构观察

对性成熟卵胎生鱼类剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的精巢进行了显微和超微结构的观察.结果显示,剑尾鱼具一对索状精巢,其内部呈小管型.精巢内每一精小囊的生殖细胞发育同步,从精子发生到成熟精子的形成,精小囊逐渐由小管盲端向中央腔方向移动,在迁移过程中逐渐发育.剑尾鱼的精子发生经过精原细胞,初级精母细胞,次级精母细胞,精细胞及变态精子、成熟精子等阶段.剑尾鱼成熟精子分为头部、中段、尾部3个部分.     

动物精子发生及成熟过程中凝集素受体的分布与变化

对各种动物精子发生与成熟过程中生精细胞表面凝集素受体的变化做了综述 .精子发生过程伴随着不同凝集素受体的出现和变化 ,这些受体是由生精细胞自身合成的 ;精子在成熟过程中 ,质膜凝集素受体的合成、修饰及分布会进一步发生变化 ,这些变化与精子获得与卵子进行识别、粘附、结合等受精能力密切相关 .     

北京鸭精子发生过程的电镜观察

应用电子显微镜研究了北京鸭的精子发生过程。初级精母细胞有一个分化的过程,其细胞核的顶部上方有一个由高尔基体和线粒体组成的高尔基区,这一区和核内染色体的出现有明显的位置相关,并随着减数分裂的进行而分散。观察了精细胞变态过程中细胞核的形态和结构的变化。探讨了由高尔基体形成顶体、由远端中心粒和线粒体形成中段、由远端中心粒的未端形成尾丝的过程。发现包围细胞核的微管随着精子的发育而层数逐渐增多,此微管系统的变化与精子头部核的定型有关。     

中国龙虾Panulirus stimpsoni(Holthuis)的精子发生

本文报导了光学显微镜、透射电子显微镜和扫描电子显微镜研究中国龙虾Panuliurus stimpsoni(Holthuis)精子发生的结果。
中国龙虾的精子发生经过精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子。成熟分裂前期由细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期组成。精细胞的变态经过早期精细胞、顶体颗粒期、顶体囊期、顶体分化期和成熟精子。精子属非典型精子,没有鞭毛,不能运动。在扫描电镜中,成熟精子呈绒毛球状。在透射电镜片中,每个精子有核、板层区和顶体。核内有分散的染色质和微管。突起从核发出,核中的微管也伸进突起,顶体和板层区也见到突起。板层区包含有大量的膜和少量退化的线粒体。由高尔基复合体产生的顶体可以分成均质部、旋涡部、晶体部和绒毛部。     

哺乳动物精子发生及其基因表达调控

精子发生的过程是一个受机体严密调节的过程,其中包括激素调节、睾丸旁分泌因子的调节和其它信号分子的调节,睾丸特异性表达的基因在这一调节过程中发挥着重要的作用。研究睾丸特异性表达基因的功能的最终目的是阐述精子发生的机理和发现新一代高效、特异、可逆的男性避孕药物的靶蛋白基因。     

Analysis of gene expression patterns with cDNA microarray during late stage of spermatogenesis in mice

The differentiation process of round spermatids to spermatozoa during the late stage of spermatogenesis is called spermiogenesis. To explore spermiogenesis-related genes, cDNA microarray was used to study expression patterns of 1176 genes in pachytene spermatocytes, round spermatids and elongating spermatids of Balb/c mice. The results showed that 208 genes were detected in all the three cell types. Most of them were down-regulated from pachytene spermatocytes to round spermatids and elongating spermatids. However, up-regulation of 7 genes expression in round spermatids and 3 genes in elongating spermatids were found. Expression of 7 differentially expressed genes in cDNA arrays was further confirmed by semi-quantitative RT-PCR study. The RT-PCR results indicated that the expression of 6 genes was consistent with that in cDNA arrays, only one gene did not show differential expression by RT-PCR. These results may provide important clues for studying of expression, regulation, and function of spermiogenesis-related genes.     

睾丸支持细胞功能的研究进展*

摘要: 支持细胞位于睾丸曲细精管内皮,作为与生精细胞接触的惟一体细胞,在生精过程中起着至关重要的调控作 用。支持细胞在精子发生过程中可为精子细胞提供结构支持; 他分泌的各种蛋白质参与精子发生所需物质的转 运; 同时支持细胞表达一些膜蛋白,促进局部免疫豁免形成,为精子发生提供有利的微环境; 再者,支持细胞通过发 挥粘附与吞噬作用,清除精子发生中凋亡的精子细胞。随着研究的深入,近年来对支持细胞又有了新的认识。     

Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors

Male infertility is a long-standing enigma of significant medical concern. The integrity of sperm chromatin is a clinical indicator of male fertility and in vitro fertilization potential: chromosome aneuploidy and DNA decondensation or damage are correlated with reproductive failure. Identifying conserved proteins important for sperm chromatin structure and packaging can reveal universal causes of infertility. Here we combine proteomics, cytology and functional analysis in Caenorhabditis elegans to identify spermatogenic chromatin-associated proteins that are important for fertility. Our strategy employed multiple steps: purification of chromatin from comparable meiotic cell types, namely those undergoing spermatogenesis or oogenesis; proteomic analysis by multidimensional protein identification technology (MudPIT) of factors that co-purify with chromatin; prioritization of sperm proteins based on abundance; and subtraction of common proteins to eliminate general chromatin and meiotic factors. Our approach reduced 1,099 proteins co-purified with spermatogenic chromatin, currently the most extensive catalogue, to 132 proteins for functional analysis. Reduction of gene function through RNA interference coupled with protein localization studies revealed conserved spermatogenesis-specific proteins vital for DNA compaction, chromosome segregation, and fertility. Unexpected roles in spermatogenesis were also detected for factors involved in other processes. Our strategy to find fertility factors conserved from C. elegans to mammals achieved its goal: of mouse gene knockouts corresponding to nematode proteins, 37% (7/19) cause male sterility. Our list therefore provides significant opportunity to identify causes of male infertility and targets for male contraceptives.     

猪Zfx基因RNAi片段的筛选

为了研究Zfx基因在精子发生过程中的作用,本实验利用RNA干扰技术针对猪Zfx基因m RNA的不同靶位设计构建了4个不同的sh RNA干扰载体:3个RNAi-Ready-p SIREN-Retro Q-Zs Green(p SIREN)质粒重组载体(a、b、c),1个p LL3.7慢病毒骨架质粒重组载体(p LL3.7-sh RNA)。通过对仔猪睾丸体外培养生精细胞中的Zfx基因进行人为干扰后,提取总m RNA,利用q RT-PCR对Zfx基因m RNA表达进行丰度测定。结果表明:p SIREN质粒重组载体干扰组对Zfx基因没有明显地作用,慢病毒骨架质粒重组载体干扰组对Zfx基因表达抑制效果显著,抑制率为51%(P﹤0.05)。结论:筛选获得了慢病毒骨架质粒重组干扰载体,其对仔猪睾丸体外培养生精细胞中的Zfx基因表达具有显著地干扰作用。     

Homology of a candidate spermatogenic gene from the mouse Y chromosome to the ubiquitin-activating enzyme E1.

The Sxr (sex-reversed) region, a fragment of the Y chromosome short arm, can cause chromosomally female XXSxr or XSxrO mice to develop as sterile males. The original Sxr region, termed Sxra, encodes: Tdy, the primary sex-determining gene; Hya, the controlling or structural locus for the minor transplantation antigen H-Y; gene(s) controlling the expression of the serologically detected male antigen (SDMA); Spy, a gene(s) required for the survival and proliferation of A spermatogonia during spermatogenesis; Zfy-1/Zfy-2, zinc-finger-containing genes of unknown function; and Sry, which is probably identical to Tdy. A deletion variant of Sxra, termed Sxrb, which lacks Hya, SDMA expression, Spy and some Zfy-2 sequences, makes positional cloning of these genes possible. We report here the isolation of a new testis-specific gene, Sby, mapping to the DNA deleted from the Sxrb region (the delta Sxrb interval). Sby has extensive homology to the X-linked human ubiquitin-activating enzyme E1. The critical role of this enzyme in nuclear DNA replication together with the testis-specific expression of Sby suggests Sby as a candidate for the spermatogenic gene Spy.     

多肠目薄背涡虫生殖细胞发生的组织学研究

将薄背涡虫（Notoplana humilis）制成石蜡切片,通过光学显微镜观察其生殖细胞的发生过程．结果表明：薄背涡虫的精巢可划分为6个时相,每个时相的生精细胞组合图像不同,精子发生先后经历精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子;卵子发生先后经历卵黄发生前期的卵母细胞、卵黄发生期的卵母细胞、成熟的卵母细胞以及受精卵．对精子发生过程中各级生精细胞的特征以及卵子发生过程中各级卵细胞的特征进行了描述．     

小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究

 以1天龄、未成熟(3周龄)、成熟期(10周龄以上)的昆明正常小鼠睾丸组织为实验材料,利用地高辛标记的Si1基因探针在其组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交,探讨Si1基因在小鼠睾丸发育过程中的表达变化.同时,分别在生后15,20 d及25 d的昆明小鼠睾丸组织切片上进行凋亡细胞原位检测,验证小鼠睾丸上述发育时期的细胞凋亡情况.结果发现:①Si1基因在1天龄小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号;在未成熟小鼠的睾丸组织部分生精上皮内有极强的杂交信号;在成熟小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号.②小鼠睾丸组织生精上皮内,凋亡细胞数从生后第15-20天呈增加趋势,于生后第20天出现峰值,生后第25天又降低.上述结果表明Si1基因可能参与了小鼠睾丸的发育过程,在小鼠睾丸发育的特定时期发挥作用,由于Si1基因的表达与小鼠生精细胞凋亡发生的时期同步,表明该基因可能与小鼠睾丸发育过程中的细胞凋亡有关.