苜蓿花叶病毒RNA23''''端cDNA转基因烟草的研究

将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV—Ch)RNA23′端cDNA重组到植物表达载体pROKⅡ中，用三亲融合法导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，采用叶圆片法转化普通烟草，诱导再生小植株．经卡那霉素抗性筛选和PCR检测，证明AIMV RNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.     

苜蓿花叶病毒RNA2 3''''端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1／2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV-Ch)RNA：3′端cDNA，重组到植物表达载体pROKⅡ中，通过致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，以叶圆片为转化材料，转化普通烟草，并获得了转基因植株．经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明．AIMV RNA：3′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性．     

商陆抗病毒蛋白cDNA的植物表达载体构建及转化烟草的研究

以商陆抗病毒蛋白的cDNA序列为依据,设计特异性引物,应用PCR技术扩增出5′端含有BamHI,3′端含有KpnI限制性内切酶酶切位点的目的片段,且在序列的开始和结尾分别加入起始密码子ATG和终止密码子TAA,将该目的片段定向克隆于载体pROKII中与CaMV35S启动子和Nos末端构成植物表达载体pRPAP,通过菌落直接PCR法和酶切分析鉴定出阳性重组子,用直接导入法将其导入农杆菌EHA105,以此作为工程菌进行烟草转化,对筛选到的阳性植株随机取样进行Southern印迹分析,结果表明,PAP基因已经整合到烟草基因组中,证明载体构建成功。     

四膜虫有性生殖过程中特异表达基因TCD3的序列分析

含有CHROMO(chromatin organization modifier)结构域的蛋白参与了染色质结构的调节.本研究从嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)全基因数据库(www.ciliate.org)和基因表达数据库(tged.ihb.ac.cn)中筛选到有性生殖特异表达TCD3(Tetrahymena chromo domain-containing protein 3)基因.该基因ORF为1 005bp,大核染色体中基因全长1 241bp,含有两个内含子.5′-RACE和3′-RACE表明5′端非编码区(5′-UTR)长度为40bp,3′端非编码区(3′-UTR)长度为90bp.TCD3基因预测编码334个氨基酸构成,含有一个CHROMO结构域.CHROMO结构域聚类分析表明四膜虫Tcd3蛋白可能与线虫CeCDP功能类似,参与异染色质的形成和DNA序列删除.     

麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IPI)启动子的克隆及瞬时表达分析

本文以麻疯树基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因(JcIPI)起始密码子上游1 536bp的启动子序列.利用在线软件PLACE和PlantCARE分析表明该序列除具备TATA-Box、CAAT-Box等启动子基本元件外,还含有AuxRR-core、TATC-box、MBS、HSE等特异性元件.为确定启动子核心启动区域,构建JcIPI启动子283、550、970、1 276和1 536bp的5′端缺失片段,并将其分别驱动pBI121载体的葡萄糖苷酸酶(GUS)基因,构建植物表达载体.采用农杆菌介导法转化烟草,在烟草叶片中进行瞬时表达分析.GUS酶活测定结果显示,五个启动子缺失片段都具有启动子活性,并随长度增加而增强.     

NM23—H1和NM23—H2可切割血小板起源的生长因子—A基因启动子中的核酸酶敏感成发

PDGF－A基因的转录由几个GC丰富的、高度单链的、非B型结构的增强子和沉寂成发所调节，其中一个沉寂子位于PDGF－A启动了远上游5′端（－1418－1388），命名为5′SHS。重组人NM23－1T上和NM23-H2可分别在3′和5′端切割单链、双链形式的5′SHS的两条链，表明NM23－H1和NM23－H2在不同位点，以不同机制切割5′SHS.NM23－H1和NM23－H2也可分别在3′和5′端切割双链形式的PDGF－A启动子中的NHE成分（－82－－50）；此外，NM23－H1也可在3′端切割PDGF－ANHE成分的无意义链（Py链）。     

一种cDNA-5′末端的克隆方法

应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶 (TDT)在cDNA 5′末端加同聚物尾的方法 ,通过延长加尾时间、改变加尾步骤 ,大大加强了加尾效率 ,使得在cDNA末端快速扩增技术 (RACE)中应用TDT加尾法进一步获得mRNA的 5′端成为一种行之有效的方法 .     

苦瓜McAG2启动子的克隆与表达研究

文中从苦瓜基因组中克隆得到长为1417 bp的McAG2基因5′上游片段并进行了DNA序列分析.通过PCR得到了其缺失片段,将其插入pBI121载体替换CaMV35S启动子,得到了McAG2基因5′侧翼缺失表达载体.并利用农杆菌介导转化烟草,建立了相应的转基因烟草植株,以研究其在不同器官组织中的表达特性. β-glucuronidase(GUS)染色结果显示该启动子在转基因烟草叶片和根组织中没有表达活性.     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

烟草NtCDC48基因的克隆及功能分析

利用裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）系统从烟草BY-2悬浮细胞中分离得到了NtCDC48 cDNA序列， 全长2729bp，包括74bp的5′端非翻译区，2427bp的开放阅读框以及228bp的3′端非翻译区，可读框编码808个氨基酸，推导蛋白含有两个典型的ATPase模块（aa：245—374；518—646）. 在烟草悬浮细胞中过量表达NtCDC48能显著提高烟草BY-2细胞的有丝分裂指数，并导致纺锤体微管列阵的两极结构由相对集中转换为极端弥散状态. NtCDC48GFP融合蛋白在细胞周期M期的亚细胞定位结果表明，NtCDC48随细胞周期进程发生有规律的变化.这些结果表明NtCDC48在植物细胞有丝分裂进程中发挥着重要作用.     

核酸适配体氯化血红素比色法检测牛奶中的氯霉素

利用一种基于适配体氯化血红素(hemin)比色分析法快速检测牛奶中的氯霉素(chloram-phenicol,CAP)含量.设计两条DNA链,其中一条为CAP的核酸适配体,在其3′端修饰氯化血红素;另一条为CAP核酸适配体的互补链(cDNA),在其5′端修饰hemin.当体系中无CAP时,两条DNA单链杂交形成DNA双...     

转APX基因烟草抗旱能力研究

用毛白杨中克隆得到的抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因,构建植物表达载体pBI121-APX,将pBI121-APX载体用农杆菌介导法转化烟草,成功得到转基因烟.PCR、PCR-Southern的结果表明,APX基因已经成功的整合到转基因烟草基因组中.干旱实验结果表明,与对照相比较,转基因烟草表现出较强的抗旱性.     

一种改进的小非编码RNA cDNA文库构建方法

本文使用RNA Antisense Purification(RAP)技术富集纯化sncRNA,有效去除了5S、5.8SrRNA.联合使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)和RNA 5′Polyphosphatase处理sncRNA,将5′-端为非单磷酸结构的sncRNA转变成单磷酸结构,增加了文库覆盖率.在sncRNA3′-端添加poly(A)尾结构以及使用oligo(dT)16VN-adapter锚定引物进行逆转录,间接解决了sncRNA 3′-端接头定向连接问题,不再使用价格昂贵的腺苷化接头.改进后的sncRNA cDNA文库容量为3×105cfu,重组率为95%,且测序结果显示,获得的cDNA序列具有较好的完整性.使用这种成本低且行之有效的改进方法,为深入研究sncRNA奠定了基础.     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP_2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50pg的病毒RNA.     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5''端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northern blot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50 pg的病毒RNA.     

甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及其转基因研究

将以ATP6作为诱饵蛋白,应用酵母双杂交(Yeast Two Hybrid,Y2H)已筛选到的3′端含有终止密码子的一个片段,通过5′RACE获得该基因全长并,命名为Bn-Zn,其编码氨基酸序列中含有一个RINGv(RINGvariant)结构.通过构建该基因的真核正向表达载体pCAMBIA2301G-Bn-Zn,以农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转入细胞质雄性不育恢复系油菜8410018幼苗下胚轴,经过诱导愈伤和再分化,成功得到了转基因植株.     

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段.通过T4 DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段.经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致.     

低聚肽分子结构与其薄层色谱Rm的关系

利用23种与吗啡衍生物有关的低聚肽薄层分析的实验结果计算证明,lnR_M值可看作是构成这些化合物的各基团贡献的总和。实验值lnR_M与计算值lnR′_M很好相符。lnR′_M=sum from n_i lnR′_(Mi),式中lnR′_(Mi)是i基团的lnR′_M值,n_i是分子中i基团的数目,lnR′_(Mi)是由R_M的实验值用最小二乘法计算出的。文中还初步讨论了流动相组成对lnR_M的影响。     

杂交鹅掌楸LhARF2基因启动子的克隆及瞬时表达分析

生长素响应因子(Auxin response factor, ARF)参与调控植物生长发育的多个途径。本研究利用Tail-PCR技术从杂交鹅掌楸中克隆LhARF2基因5′端上游2 637 bp序列,即pLhARF2启动子,并利用生物信息学软件PlantCARE分析其包含的调控元件,发现其含有启动子必需元件TATA-box和CAAT-box,以及压力响应、激素响应、光信号转导和代谢循环过程元件。构建pLhARF2-pCAMBIA1300:GUS植物表达载体并瞬时浸染本氏烟草叶片,利用GUS组织化学染色法鉴定烟草叶片中瞬时表达活性,发现在烟草叶片中有蓝色斑块,但颜色较浅。实验结果推测杂交鹅掌楸pLhARF2启动子可以调控GUS基因活性,为下一步研究启动子遗传转化的组织表达活性奠定了基础。