基因组印迹的调控机制及其对动物克隆的影响

基因组印迹是一种表观遗传学调控方式．依据亲源性的不同机体仅表达来自亲本一方的等位基因,而来自另一方的等位基因不表达,这类基因称为印迹基因．印迹基因成簇存在,受该簇内的印迹控制区（imprintingcontrolregion,ICR）调控．基于ICRs的功能,研究者提出两种模式解释基因组印迹的机制：绝缘体印迹模式和非编码RNA印迹模式．印迹基因的正确表达对哺乳动物的正常发育极为重要,错误的印迹会引起严重的遗传性疾病和癌症．克隆动物发育异常也可能与之相关．结合本研究组最近的研究,文中综述了基因组印迹的调控机制及其对动物克隆的影响．     

新基因BP1抗体制备及其在乳腺癌表达的初步观察

为了探讨新同源盒基因BP 1在乳腺癌的表达,运用生物信息学方法设计19肽,合成并偶联到大分子载体KLH上制成人工免疫原,制备兔抗BP 1多克隆抗体IgG.蛋白印迹方法检测BP 1在乳腺癌细胞系M CF 7、M DA-M B-231细胞均有表达:免疫组织化学结果显示,BP 1蛋白在乳腺癌的表达率显著高于癌旁组织,在雌激素受体阴性肿瘤的表达率高于雌激素受体阳性组。BP 1基因的异常表达参与了乳腺癌的发生,是一种新的乳腺癌分子标志物.     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.     

筛选差异表达基因的方法进展

植入前胚胎差异表达基因的筛选是分离、鉴定发育相关基因的关键 ,是克隆动物发育分子机理研究的基础 .哺乳动物植入前胚胎和克隆胚胎材料的获得十分不易 ,使得筛选差异表达基因的方法在该领域的应用均受到较大的限制 .以DDRT -PCR为基础的单胚mRNA差异表达技术的建立 ,为克隆植入前胚胎发育相关基因及哺乳动物克隆胚胎发育分子机理研究提供有力的工具 ,本文将在多年研究基础上对该技术及目前筛选差异表达基因的方法进行综述 .     

果蝇基因组功能区域组蛋白修饰的协同模式

基于"组蛋白密码"假设,以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)为研究对象,应用CoSBI(coherent and shifted bicluster identification)算法对黑腹果蝇Oregon-R细胞株培养14-16h的胚胎细胞,在全基因组范围、RNA聚合酶Ⅱ结合区域、绝缘子结合蛋白的结合区域的22种组蛋白修饰的分布情况进行CoSBI聚类分析,发现了果蝇基因组的功能区域所具有的一些"核心组蛋白修饰",说明果蝇基因组的组蛋白修饰具有成簇出现、相互协同的调控模式.另外,将黑腹果蝇处于14-16h胚胎细胞的基因分为表达与不表达两类,分析了两类基因所在区域组蛋白修饰的组合模式.     

蝴蝶兰PhAP3基因的表达特性研究

为了探索蝴蝶兰中MADS盒基因在花发育过程中对花器官发育的调控机制,目前从蝴蝶兰中克隆出一个MADS盒基因家族B族基因PhAP3,并对其进行了序列分析和基因表达研究.聚类分析结果表明PhAP3是拟南芥AP3基因的同源基因,但基因表达分析表明PhAP3可以在植物的营养器官和生殖器官中均有表达,这与典型的AP3类基因有所不同.     

烟草ftsZ基因表达对质体发生的影响

FtsZ是广泛存在于原核生物和高等植物中的一种功能蛋白,它控制着原核细胞和质体的分裂过程.为进一步认识原核细胞和质体分裂的分子机制及真核细胞的起源和进化等重要问题,研究了该基因的表达调控特征.从烟草克隆ftsZ cDNA,构建了谷胱甘肽转移酶(GST)与FtsZ融合蛋白的表达质粒,并将其导入到在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下能高效表达的大肠杆菌JM109中.高表达的融合蛋白通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,用以免疫兔子制备抗血清.免疫印迹法表明烟草ftsZ基因的表达具有明显的组织器官特征,在质体(叶绿体)分裂活跃的部位表达强,其表达量为幼嫩花瓣>幼叶>幼根>老叶>茎.黑暗培养1d对ftsZ基因表达似乎无影响,随黑暗培养时间延长,FtsZ蛋白表达逐渐降低,叶绿体转化成为体积小、数目众多(增加2～3倍)的淡黄色或白色质体.该实验结果证明,光对植物ftsZ基因表达很可能无直接影响,ftsZ基因表达的强弱是决定质体(叶绿体)分裂和细胞中质体(叶绿体)数目多少的主要原因之一.     

嗜热菌Thermus thermophilus HB8铁硫簇合成途径中IscA和IscU蛋白的表达、纯化和功能研究

Fe-S簇可参与电子传递和基因调节等过程.实验以嗜热菌Thermus thermophilus HB8基因组为模板,通过PCR扩增获得Fe-S簇ISC系统生物合成途径中的IscA和IscU基因,并克隆连接到表达载体pET-28a(+)上.重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3)进行表达,用亲和层析纯化得到浓度和纯度都较高的IscA和IscU蛋白.SDS-PAGE分析,证实其分子量大小分别为13.7KD和14.8KD.实验确定IscA是单聚体,IscA上能形成铁硫簇,IscU上不能形成铁硫簇.在厌氧条件下,RNA的量能提高1.5倍,但是IscA和IscU的表达量都会降低,说明厌氧对这两个基因有损伤.     

嗜热菌Thermus thermophilus HB8铁硫簇合成途径中IscA和IscU蛋白的表达、纯化和功能研究

Fe-S簇可参与电子传递和基因调节等过程.实验以嗜热菌Thermus thermophilus HB8基因组为模板,通过PCR扩增获得Fe-S簇ISC系统生物合成途径中的IscA和IscU基因,并克隆连接到表达载体pET-28a（＋）上.重组质粒转化E.coli Rosetta（DE3）进行表达,用亲和层析纯化得到浓度和纯度都较高的IscA和IscU蛋白.SDS-PAGE分析,证实其分子量大小分别为13.7KD和14.8KD.实验确定IscA是单聚体,IscA上能形成铁硫簇,IscU上不能形成铁硫簇.在厌氧条件下,RNA的量能提高1.5倍,但是IscA和IscU的表达量都会降低,说明厌氧对这两个基因有损伤.     

牡蛎全基因组测序与功能解析

围绕牡蛎全基因组测序、基因组结构分析、基因注释、重要功能基因发掘和SNP标记开发几个目标展开了研究。采用fosmid克隆混池和等级组装策略成功解决了牡蛎高杂合度带来的基因组拼接困难,得到的基因组Contig和Scaffold N50分别达到19.4 Kb和401 Kb,整体测序深度大于800倍覆盖度。为后续的研究奠定了基础。对牡蛎基因组结构特征进行了分析。其基因组杂合度达到2.3%,重复序列丰富。在全基因组水平筛查到SNP位点312万个,其中基因区的SNP分布少于非基因区。共注释得到基因28 000多个。通过38个发育时期的表达谱测序,筛选到具有不同生物学含义的功能基因集,发掘了大量与生长发育等相关的基因,并对一些基因进行了详细研究。对牡蛎母本效应基因进行了发掘。鉴定出1 307个在雌性性腺中特异高度表达的基因,526个雄性性腺中特异高度表达的基因,包括一些重要的父本效应基因,如K81等。对性别决定基因进行了分析,发现Sox9、SRY等基因在牡蛎雄性性腺中特异表达,可能是决定牡蛎雄性转变的重要调控基因。对重要的发育基因家族进行了详细梳理和进化分析,包括130多种Homeobox基因、20多种Fox基因、10多种Wnt基因等。此外,对一些重要的功能基因如表皮生长因子受体(EGFR)和固醇调节原件结合蛋白(SREBP)等还进行了原味杂交、蛋白重组表达等功能研究。在全基因组范围以及转录区筛选到大量的SNP标记,在一些群体中验证了超过1 500个具有多态性的SNP。并把HSP、类胰岛素多肽等基因的SNP与表型性状进行了关联分析研究,发现一些与生长性状具有显著相关性的SNP标记。由于冠轮动物超门基因组数据缺少,牡蛎基因组的测序为生物多样性和进化生物学研究提供了重要数据。为牡蛎高度适应潮间带环境的分子机制研究提供了重要基础。项目的完成对贝类发育、贝壳形成、海洋无脊椎动物浮游幼虫的进化等机制有了更深入的理解。研究成果丰富了海洋基因资源,开发了大量分子标记,为分子育种的开展提供了条件。     

重组猪生长激素抗体的制备与纯化

为了获得重组猪生长激素抗体,对重组猪生长激素融合基因的真核表达产物进行免疫印迹(Western blot)检测,将利用DNA重组技术构建的重组质粒pPGH020在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行诱导表达.表达产物经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化的重组猪生长激素融合蛋白.然后以此为抗原免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体,抗体再经硫铵沉淀、透析和亲和层析纯化.Western印迹结果表明,该纯化抗体显示了良好的免疫反应,其灵敏度比兔抗rpGH抗血清提高50倍,为猪生长激素融合基因在真核细胞的表达及功能鉴定奠定了基础.     

即刻早基因ZENK的基因功能及其应用进展

即刻早基因ZENK是核基因组内编码转录因子的单拷贝基因,它受多种胞外信号,如血清、生长因子、细胞因子和激素的作用在不同类型细胞内迅速、大量表达.ZENK蛋白通过C2H2型锌指识别靶基因启动子中的GC丰富序列并发生作用,从而调控靶基因的转录.ZENK基因参与细胞生长、分化、发育的调控,而且其在大脑的诱导表达与动物的学习、记忆密切关联.另有研究显示,ZENK具有很高的进化保守性,可以作为新的分子标记运用于分子系统学研究.     

PCR法克隆卤虫（Artemia franciscana） Artemin基因上游调控序列

利用限制性内切酶(Dra I和Hpa I)对卤虫(Artemia franciscana)基因组DNA进行酶切后，连上接头构建基因组“DNA文库”(即未克隆，带接头的DNA片段)，再以TD-PCR(Touch-down PCR)的方法扩增卤虫的Artemin．基因的上游调控序列，得到一段大为750bp的片段，将这一上游序列片段克隆到pMDl8-T载体中，以获得包括启动子、增强子等顺式作用元件在内的Artemin基因的上游调控序列，为进一步研究Artemin基因的表达模式及其功能提供依据。     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5''端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物，以绵羊基因组DNA为模板，PCR扩增出1042bp的特异性片段，连接到pMD19T载体中获得该片段克隆．经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段．DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5＇端调控区序列相比具有很高的一致性．研究结果为今后制备转基因克隆动物，在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础．     

猪骨形态发生蛋白15基因的分子克隆及分析

骨形态发生蛋白15(Bone Morphogenetic Portein-15,BMP15)由卵母细胞特异表达,在卵母细胞发育与成熟过程中起重要调控作用.本文以长白猪为研究模型,克隆BMP15基因cDNA全长并探究该基因组织表达图谱.研究显示,家猪BMP15基因cDNA全长1298bp,编码具402个氨基酸的前体蛋白.依赖RT-PCR技术,家猪Bmp15基因被发现特征性表达于家猪卵巢中.在本研究中,还分离到家猪BMP15基因潜在启动子区(3279bp),针对该启动子区,部分转录因子结合位点获得预测.这些研究结果为探究BMP15基因的表达调控机制及其对家猪卵泡发育影响奠定基础.     

增强子对基因表达的调控:从新技术到新机制

全基因组研究已经鉴定了人类基因组中数以百万计的增强子调控元件,然而它们的生物学功能和潜在作用机制在很大程度上仍然未知.本文回顾了应用于鉴定、描述和验证增强子的新兴高通量技术,并进一步讨论对增强子潜在调控机制的生物学理解,特别是关于增强子簇如何控制基因表达的研究,如超级增强子的功能层次结构等.最后总结了增强子在发育、进化...     

赤狐ESR1基因启动子的克隆及生物信息学分析

对赤狐ESR1基因启动子区转录因子结合位点进行了预测,为今后研究其转录调控机制提供参考依据.以赤狐基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增克隆ESR1基因启动子序列,并构建至双荧光素酶报告基因载体;利用生物信息学方法对ESR1基因核心启动子区的关键转录因子结合位点进行预测.成功克隆出赤狐ESR1基因5'上游1880 bp...