亚栖热菌产海藻糖合酶培养基的优化

对亚栖热菌CBS-01菌株发酵生产海藻糖合酶的培养基进行了优化.首先通过碳源、氮源实验,选出了适宜的碳、氮源,随后采用Plackett-Burman设计法对培养基中的组分进行了筛选,找出影响产酶的主要因素为蛋白胨和酵母膏,最后利用中心组合设计及响应面分析法求出了主要影响因素的最佳浓度,得到优化的发酵培养基配方(g/L):可溶性淀粉5,蛋白胨8.6,酵母膏1.725,NaNO3 0.7,氨三乙酸0.5,Na2HPO4 0.1,MgSO4·7H2O 0.2,CaCl2 0.1.10 L罐发酵实验表明,CBS-01菌株海藻糖合酶的合成属生长关联型,利用优化的发酵培养基,CBS-01菌株的产酶水平由0.2 U/mL提高到0.41 U/mL.     

QS412透性化细胞产海藻糖特性研究

透性化细胞中在麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶作用下由淀粉生产海藻糖,其使用可省略酶的纯化和胞内酶的固定化。本文研究了金属离子对透性化细胞产海藻糖活性的影响,观察到Mg²⁺对其活性有提高作用,Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺5种2价离子对其活性有明显抑制作用。其中,Hg²⁺的抑制作用最为明显,而Mn²⁺的作用未见报道。Zn²⁺在40mmol/L浓度以上能完全抑制体系中MTHase的活性,并且这种抑制作用可以通过添加EDTA消除,这就提供了制备MTHase底物及在两种酶存在下单独测定MTSase活性的可能。本征动力学和宏观动力学分析表明透性化细胞合成海藻糖的过程中外扩散影响可忽略,内扩散影响显著。通过对该过程作用特性的研究,为透性化细胞的研究和使用打下进一步的基础。     

乳化法制备交联海藻糖合酶聚集体的研究

交联酶聚集体(CLEAs)是一种高活性的无载体固定化酶,常用的基于溶液法(Sheldon CLEAs呈无定形的集簇体,影响其连续使用效率.以海藻糖合酶为模型酶,首次在油包水乳化体系CLEAs,利用扫描电镜和光学显微镜分析了所得CLEA的微观结构,考察了CLEAs的活性和重复使果表明,乳化法制备的CLEAs外观呈较规则的微球形,粒径约20~60μm,其活性和重复使用性能均Sheldon法制备的CLEAs.     

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法,从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因（TreY）,扩增产物大小为2．2kb,将扩增片段与pUCm-T连接,得到重组质粒pUCm-T-TreY,CaCl2法转化DH5α,并筛选阳性克隆。用BamHI／Ndel分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a,连接后得重组pET21a-TreY,转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为74kDa的特异条带,同核苷酸序列所推导的值相符。     

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究

以已知晶体结构的Pseudomonas mesoacidophila MX-45菌株海藻酮糖合成酶（MutB）的晶体结构为模板,在SWISS-MODEL模建立谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）海藻糖合成酶的立体结构,并对初始结构作能量优化,通过氨基酸序列比对,选择TreS-glu保守区内的氨基酸R245、D247、E289、F244和保守区外的氨基酸A288进行定点突变,并对突变酶F244C、F244L、F244W、F244Y、A288G、R245X、E289X、D247N、D247E进行纯化和酶学性质研究,比较突变子对酶活性和热稳定性的影响。结果表明,R245、E289突变为其它的19个氨基酸后酶活力全部丧失,D247E和D247N也丧失酶活,F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力分别降低到TreS-glu的38%、24%、62%、64%和35%,A288突变成T288后没有酶活。与TreS-glu相比,F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低,F244Y的最适反应温度和TreS-glu相同,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G的最适温度提高到32℃。与TreS-glu相比,突变酶的最适反应pH值均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G的为7.5,比TreS-glu的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W的为6.5,比TreS-glu的8.0均下降了近1.5个单位。与TreS-glu相比,突变酶的热稳定性均有不同程度提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比TreS-glu的提高约1℃,F244L提高约2℃,F244C提高了近4℃。     

纤维微菌海藻糖合成酶基因克隆表达及酶学特性鉴定

【目的】开发适用于海藻糖生产的新型海藻糖合成酶。【方法】通过反向PCR技术,从一株纤维微菌的基因组DNA中获知海藻糖合成酶基因完整ORF序列,进而克隆得到纤维微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS),将其与表达载体pSE380构建重组质粒后转入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,通过镍柱亲和层析纯化得到纯酶并进行酶学性质测定。【结果】从纤维微菌中克隆并在大肠杆菌中成功表达海藻糖合成酶基因(CCTreS)。经纯化获得的重组酶(CCTreS)在以麦芽糖为底物生成海藻糖时,最适反应pH值为7.0,最适反应温度为45℃,40℃保温1h仍具有80%以上的相对酶活力,在pH值5.5~8.5保存24h,相对酶活力仍保留80%以上。Cu~(2+)对其有明显抑制作用。【结论】该重组酶具有很好的热稳定性和pH稳定性,具有一定的研究价值和潜在的工业应用价值。     

脱乙酰几丁质的制备及其对细胞透性和脱乙酰几丁酶活性…

虾壳经盐酸和氢氧化钠处理，高锰酸钾漂白，制得几丁质，几丁质经５０％ＮａＯＨ处理，获得脱乙酰几丁质，制得的脱乙酰几丁质能溶于３％醋酸中。植物离体叶片经不同浓度脱乙酰几个质处理，用电导法和染料结合法，分别测定细胞中电解质和蛋白质的外渗量，用分光光度法测定脱乙酰几丁酶的活性。结果表明，脱乙酰几丁质能使多种植物电解质的外渗量增加，脱乙酰几丁质的浓度愈大，处理的时间愈长，则外渗量增加愈显著。易染赤霉病的小麦     

海藻糖合酶磁性交联酶聚集体的制备及其性质研究

采用一步法合成了氨基化MNPs,以其为磁源,制备了海藻糖合酶M-CLEAs,考察了M-CLEAs的制备条件和酶学性质.结果表明,当酶蛋白与壳聚糖修饰的磁性粒子(MNPs-CS1)、戊二醛及壳聚糖浓度比分别为1∶4、1∶1、1∶2时,所得海藻糖合酶M-CLEAs的酶活回收率最高,达到68%.海藻糖合酶M-CLEAs的最适反应温度为60℃,最适反应p H为7.0,对热和p H的耐受性均优于游离海藻糖合酶,并且具有较好的重复使用性能.     

壳聚糖固定化果胶酶的制备及其酶学性质研究

以1％壳聚糖与5％戊二醛交联8h制得交联壳聚糖载体,1g载体固定10mg的果胶酶,载体先与酶液缓慢振荡混合30min后,在固定化体系（pH3．4,4℃）中固定反应12h,该条件下制得的固定化酶强度大韧性好。酶活力回收率高达56．31％;固定化酶的最适温度50℃,最适pH3．4,Km^app值为5．42mg·mL^-1,连续使用7次后,酶活力还保留70．45％以上,具有较好的操作稳定性。     

碱性纤维素酶产生菌株的筛选及其酶学性质研究

【目的】从堆肥中筛选和鉴定产碱性纤维素酶的菌株,对菌株及其酶学特性进行研究。【方法】以刚果红平板染色法进行初筛,摇瓶发酵复筛,分离到高酶活菌株C73。通过形态观察和16SrRNA序列分析对菌株进行鉴定。采用DNS定糖法测定发酵液酶活最适pH值、pH值稳定性、最适温度、热稳定性及常见金属离子、SDS、EDTA等对酶活的影响。【结果】该菌株形态呈杆状,革兰氏阳性,不产芽孢,适宜在pH值8.0~11.0、30~37℃条件下生长。16SrRNA序列比对发现,该菌株与琼斯氏菌(Jonesiasp.)PC1序列相似度大于99%,初步鉴定为琼斯氏菌属菌株。在发酵培养基中,菌体浓度和CMCase活力分别在40h和50h达到最大值,随着发酵时间的延长发酵液pH值稳定在9.5左右。粗酶液的最适作用pH值为10.0,此时CMCase活力达2.3U/mL。在pH值8.0~11.0的范围内保持60%以上的酶活;最适作用温度为60℃,且在30~80℃的范围内保持60%以上的酶活。金属离子Mn2+、Co2+和(NH4)2SO4对酶活力有较强的抑制作用。【结论】菌株C73呈现较高的碱性CMCase酶活、较高的热稳定性和pH值稳定性,具有良好的工业应用前景。     

酵母菌中海藻糖的提取方法与糖代谢研究

采用多种方法（三氯乙酸提取法、冷乙醇提取法、热乙醇提取法和热蒸馏水提取法）从酵母菌中提取非还原性二糖海藻糖,产率分别为１３．３８％,９．６８％,９．７５％和９．５５％．并对酵母菌中海藻糖的代谢进行研究,发现随培养条件恶化,酵母菌体内海藻糖含量有不同程度的提高．提高培养基中Ｔｒｉｓ含量,则海藻糖含量趋于下降     

红细胞保存期对冻干前海藻糖负载量的影响研究

探讨冻干前红细胞保存期对海藻糖负载量的影响,确定红细胞负载海藻糖的最佳条件。在37℃条件下,4℃保存0、24、48和72 h的红细胞在海藻糖浓度800 mmol/L的负载缓冲液中孵育7 h后,检测胞内海藻糖浓度和胞外外游离血红蛋白浓度。经相同条件孵育后,4组红细胞对海藻糖的摄取量基本相同,分别为(49.747±2.253)、(50.316±0.612)、(49.768±2.179)和(49.013±1.991)mmol/L,各组之间无统计学差异。4℃保存24、48和72 h的红细胞相对于新鲜红细胞,3组负载红细胞胞外游离血红蛋白明显增加,分别高达(8.473±2.138)g/L(P0.05)、(12.697±1.787)g/L(P0.01)和(14.036±2.796)g/L(P0.01)。说明冻干前红细胞4℃保存期不会影响海藻糖负载量,红细胞负载海藻糖的主要影响因素仍为负载温度、负载时间和负载缓冲液中海藻糖浓度,若固定孵育条件,红细胞对海藻糖的胞内负载量基本保持不变。但随保存期的延长,红细胞在高渗环境中孵育更易损伤,溶血率明显增加。所以,为达到更好的海藻糖负载效果,应尽量采用新鲜红细胞进行处理。     

海藻糖对银杏叶过氧化物酶活性的影响

对银杏叶过氧化物酶热稳定性、最适pH值及海藻糖对酶热稳定性的保护作用和pH值的影响进行了初步研究.结果表明,用40℃和50℃分别处理30 min,过氧化物酶活性分别剩余78%和39%,在60,70,80℃下活性可分别维持27,18和3 min.银杏叶过氧化物酶最适pH值为6.4和9.2.加入海藻糖后酶活性略有降低(活性丧失约8%),但加热后海藻糖的保护优势得以显现,海藻糖浓度为0.14 mol/L时保护效果最好,而且不同温度处理下酶活的下降趋势均较对照组缓慢,尤其在50,60,70℃条件下,相比对照组高出12%~27%的活性,加热时间长短对海藻糖的保护效果无太大影响.经0.14 mol/L浓度的海藻糖处理后,酶活的最适pH值为6.6和9.4.     

产结晶纤维素酶的嗜热菌鉴定及其酶学性质

从云南腾冲热海温泉采集的样品中,分离出一株产结晶纤维素酶的嗜热菌TC-1.该菌株呈杆状,革兰氏阴性,生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性比对表明它属于亚栖热菌属Meiothermus.结晶纤维素、木聚糖和葡萄糖可以诱导该菌产生结晶纤维素酶,其中结晶纤维素诱导的酶活力最高.对其产生的结晶纤维素酶进行了初步纯化与酶学性质研究,该酶的最适反应温度为70℃,最适pH为6.0,在50℃～70℃和pH5.5～6.5之间酶活力相对稳定.     

气相色谱检测芦荟中海藻糖方法的建立

用1-甲基咪唑、氯化羟胺、乙酸酐将海藻糖衍生化,以气相色谱法作为定量分析手段,建立了植物组织中微量海藻糖定量检测方法.用该方法对同一种糖类衍生物进行多次分析,其特征峰保留时间误差在3 s内;能将D-葡萄糖、乳糖、蔗糖和海藻糖进行分离.海藻糖在（3.697～28.661）×10^-9 g检测量范围内其相关系数为0.998 6.利用本实验建立的植物组织中微量海藻糖定量检测的方法,分别对3年生、5年生库拉索芦荟和半年生海藻糖合成酶基因转化芦荟凝胶中海藻糖的含量进行测定,结果表明：5年生库拉索芦荟凝胶中海藻糖含量是3年生的1.59倍,每10 g凝胶匀浆中分别为1.103×10^-5 g和6.905×10^-6 g;每10 g半年生海藻糖合成酶基因转化芦荟凝胶匀浆中海藻糖含量为1.614×10^-5 g,是3年生的2.33倍.证明目的基因成功转入芦荟并已经表达.