用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达苏芸金杆菌的δ-内毒素基因

昆虫杆状病毒(IBV)是防治农林害虫的生物杀虫剂,由于其杀虫速度慢、宿主范围窄,限制了它的使用。从80年代初开始,人们不得不转向利用IBV的多角体蛋白基因(ocu)构建转移载体,表达外源基因。80年代后期,学者们再次用基因工程技术把IBV的研究转到了杀虫剂方面。     

根癌农杆菌介导的CryⅠA(b)基因在哈茨木霉菌中的转化

根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程中常规方法, 利用这一转化方法, 将CryⅠA(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中, 转化率约为60～180个转化子/106个孢子. 通过对转化子的RT-PCR检测和Southern 杂交分析表明, CryⅠA(b)基因已整合进哈茨木霉菌基因组中, 而且在转录水平上得到表达. 转化子都能够稳定遗传. 对转化子抑菌活性和杀虫活性测定表明, 转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性, 而且表现出一定的杀虫效果. 兼有杀虫防病双重作用的基因工程哈茨木霉菌的构建显示了生物技术在生防真菌遗传改良中的应用潜力.     

植物的防御性次生性物质与昆虫

植物的次生性物质是决定昆虫取食的重要因素,因而是昆虫化学生态学的重要组成部分. 一般地说,可以认为所有植物的某些器官,尤其是幼叶、幼茎和成熟的果实、种子,都具有昆虫所需要的基本营养物质.因而,德赛尔(Dethier)、费内(Feeny)、简申(Janzen)、范·恩登(Van Emden)等都认为植食性昆虫对寄主植物的专化性,是由植物中含有可以成为毒素的化学物质所决定的.这些化学物质都是植物的次生性代谢物,或称次生性物质.一种昆虫要能成功地利用某种植物作为食料,就必须具备克服其中毒素的解毒机制.当然,这同昆虫的取食特性也有很大关系.例如,同翅目、半翅目,以刺吸式口器从植物输导组织中吸取食物,而在输导组织中极少含有毒素,所以这些昆虫通常不大理会毒素问题.     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在杆状病毒载体与昆虫细胞体系中的高效表达

由杆状病毒载体和昆虫细胞组成的真核基因表达体系兼备安全可靠,对外源基因的大容量和高效表达,其表达产物具有外泌性和免疫原性以及后处理较为简易等优点,其     

海灰翅夜蛾核型多角体病毒P49蛋白的表达及其抑制细胞凋亡的机制

一个新克隆的海灰翅夜蛾核型多角体病毒（SINPV）的p49基因可抑制病毒感染引起的昆虫细胞Sf9的凋亡。用杆状病毒表达系统表达的P49蛋白的氨基酸序列与推导的氨基酸序列致,证明p49基因编码序列经克隆后能够正确表达。体内标记显示,p49基因在感染早期及晚期均可表达,以多角体基因启动子驱动p49基因的表达只是在晚期,但表达量明显高于wtSINPV合成的P49蛋白。研究结果证实,SINPV的p49基因像其他杆状病毒的凋亡抑制基因（p35)一样也是一个早期基因,但在晚期也可表达,与多角体基因启动子比较,p49基因的启动子是一个较弱的启动子。P49蛋白在体外可被人Caspase及家蚕Caspase所切割,切割后均产生约10和40ku的2个片段。P49蛋白又可明显抑制人Caspase-及家蚕Caspase对其特异底物的切割,证明P49的凋亡抑制与下游Caspase有关。     

东亚钳蝎毒中一个软瘫型抗昆虫神经毒素(BmK IT2)的初级结构研究

蝎抗昆虫神经毒素根据分子大小可分为长链(含约61或70个氨基酸残基)和短链(含约35个氨基酸残基)两大类,而前者又可根据作用效应的不同分为挛缩或软瘫两种类型.前文我们曾陆续报道了东亚钳蝎(Buthus martemsi Karsch)毒中一个挛缩型抗昆虫毒素(BmK IT)的分离及其初级结构以及一个alpha型(BmK αIT)和4个软瘫型抗昆虫毒素(BmKIT2至IT5)的纯化与鉴定.本文将进一步报道有关其中一个属软瘫型毒素(BmK IT2)氨基酸序列的测定分析结果.     

利用细菌冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌

冰核细菌是自然界中冰核活性最强的异源冰核(-1~-5℃), 已成为一种重要的生物资源. 大量研究证明, 利用冰核细菌促冻杀虫在理论上已确凿无疑, 但难以应用野生型冰核细菌冻杀田间和仓储越冬害虫, 其因有二: 其一, 野生型冰核细菌不能在昆虫肠道内长期稳定增生定殖, 易被排泄体外而丧失冻杀效果; 其二, 这些冰核细菌在植物体上附生定殖能力强, 田间施用后易诱发霜冻害. 为解决这些阻碍促冻杀虫应用中的难题, 利用自行分离的细菌冰核基因iceA, 构建了携带该基因、能进行接合转移和Tn5转座作用的工程质粒mob-Tn5-iceA, 又利用该工程质粒将冰核基因iceA整合到阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)染色体DNA上, 成功地构建了在无选择压力下冰核基因仍稳定存在并有效表达冰核活性的促冻杀虫基因工程菌. 经应用实验证明, 解决了阻碍促冻杀虫应用中的难题, 为防治我国三北地区农林果树和仓储主要越冬害虫, 开辟了一条生防新途径.     

根癌农杆菌介导的Cry IA（b）基因在哈茨木霉菌中的转化

根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程中常规方法，利用这一转化方法，将Cry IA(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中，转化率约为60～180个转化子／10^6个孢子．通过对转化子的RT-PCR检测和Southern杂交分析表明，Cry IA(b）基因已整合进哈茨木霉菌基因组中，而且在转录水平上得到表达．转化子都能够稳定遗传．对转化子抑菌活性和杀虫活性测定表明，转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性，而且表现出一定的杀虫效果．兼有杀虫防病双重作用的基因工程哈茨木霉菌的构建显示了生物技术在生防真菌遗传改良中的应用潜力．     

根癌农杆菌介导的Cry1A(b)基因在木霉菌中的转化

根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程中常规方法，利用这一转化方法，我们成功地将CryⅠA(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中，转化率约为60~180个转化子/10⁶个孢子 。通过对转化子的RT-PCR检测和Southern 杂交分析表明，CryⅠA(b)基因已整合进哈茨木霉菌基因组中，而且在转录水平上得到表达。转化子都能够稳定遗传。对转化子抑菌活性和杀虫活性测定表明，转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性，而且表现出一定的杀虫效果。兼有杀虫防病双重作用的基因工程哈茨木霉菌的构建显示了生物技术在生防真菌遗传改良中的应用潜力。     

YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移及其在F_2代中的表达

天蚕(Antherae yamamai)是天蚕蛾科柞蚕属的一种大型野生绢丝昆虫,其丝质优良,素有“丝中皇后”的美称.但天蚕和家蚕(Bombyx mori)的亲缘关系较远,为了获取具有天蚕丝质性状的家蚕转化体,利用传统的遗传育种方法是行不通的,必须借助于基因转移.YAC(Yeast artificial chromosome)作为一种大容量的基因工程载体,在真核基因转移方面有其独特的优越性.天蚕和家蚕丝质基因的主要歧异存在于核心区,这种歧异反映在蛋白质水平上就表现为     

猪腮腺分泌蛋白基因序列和蛋白结构比较分析及组织表达谱鉴定

腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein, PSP)是唾液中特异性高表达的一种蛋白, 其功能与抗菌有关. 根据人、牛和鼠的PSP基因cDNA序列设计简并引物, 通过3′和5′RACE获得猪PSP基因全长cDNA序列. 同源性分析表明, 在核苷酸和氨基酸水平上, 猪、人和牛PSP基因同源性较高. 在蛋白二级和三级结构上, 猪与人PSP的结构也非常相像, 与抗菌蛋白BPI结构类似. 蛋白功能分析发现, 猪PSP基因氨基末端含有一个特殊结构Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu, 可能对其功能有一定的意义. 通过RT-PCR, 斑点杂交和Northern杂交, 证明猪PSP基因是组织特异性表达, 只在腮腺和下颌下腺表达.     

利用基因工程培育抗虫植物

许多植物对多数害虫和病原体具有抗性:如果它们没有自身的抵抗能力,自然景观就不可能像现在这样而可能更为荒凉.然而,昆虫和致病的微生物对许多农业和园艺植物确实带来了损害.选育抗虫植物或使用农业化学药品都可以防治害虫,但是,化学防治费用较高,并且造成环境污染.因而,目前大量的研究工作主要放在改良植物自身对昆虫侵袭的防御能力方面. 起初,研究人员观察到苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)具有使多肽有效地抵抗各种昆虫侵袭的作用.苏云金芽孢杆菌在孢子形成期间产生δ-前毒素,并作为多分孢子内含物而沉积.只要敏感性昆虫吸入δ-前毒素,δ-前毒素就在这种昆     

新倍半萜酯——苦皮藤酯1的结构鉴定

研究自然生态系中的昆虫拒食成分,不仅为揭示昆虫和植物间的生物化学关系提供科学依据,而且也为创制昆虫拒食剂新农药提供天然模板。杀虫植物苦皮藤(Celastrus angulatus Maxim)的果油对蔬菜害虫黄守瓜成虫(Aulacophora femoralis),菜青虫幼虫(Pieris rapae     

酵母线粒体细胞色素b基因突变的定位和内含子的功能

酵母线粒体DNA(mt-DNA)的细胞色素b(cob)基因是由6个编码区(外显子)和5个非编码区(间隔顺序或内含子)组成的镶嵌结构。长约6.5kb,但成熟的mRNA只有2.1kb,包括全部6个外显子而无内含子。间隔顺序不仅是真核基因的普遍特点,最近发现,原核基因也有内含子。其功能容易被忽视,因此研究内含子的功能具有普遍意义。许多研究者指出,cob基因的内含子突变,不仅使酵母失去了表达细胞色素b的能力,细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因(OXi 3)也不能转录。这种既影响cob基因,又影响OXi 3     

杆状病毒对鳞翅目昆虫细胞系的寄主性

新近的统计资料表明,已在以鳞翅目为主的600余种昆虫中发现了杆状病毒.杆状病毒除了分布广、种类多以外,还由于它们作为生物杀虫剂所具有的专一性、高效性、安全性、流行性和持续性等特点,使它们在农林业和环境保护方面占重要地位.不断建立和完善起来     

基于PacBio平台的全长转录组测序

当前,绝大多数的转录组数据都是基于以Illumina平台为代表的第二代高通量测序技术获得的,但是第二代测序技术无法提供大量的长转录本并且丢失可变剪接等重要信息,因而大大制约了转录组数据的深度利用.通过以PacBio为代表的第三代测序技术,可以获得更长乃至全长转录组,但由于Pac Bio转录组测序近几年才刚兴起,只有少量的物种基于PacBio平台获得了转录组.PacBio全长转录组测序,在国际上才刚开展但发展很快,其实验与数据分析标准和质量控制方面的研究对于未来的大规模应用至关重要.本研究在国际上首次尝试依据PacBio平台最新试剂(P6/C4)优化实验参数,设计质量控制指标并使全长转录组测序标准化.本文基于一组昆虫(麻皮椿)全长转录组数据,对已取得的部分结果进行报告.     

用转基因植物控制昆虫

苏云金芽孢杆菌作为一种微生物杀虫剂使用,它比化学杀虫剂有更多的优点,因为有杀虫作用的晶体蛋白(ICPs)具有特异性,对非靶昆虫、脊椎动物、环境及使用者都无毒害作用。由于要求减少化学杀虫剂使用的压力越来越大,可以在开发改进型的苏云金芽孢杆菌产品的努力也随之增加。但目前,晶体蛋白(ICPs)在田间的稳定性还很低,产品的费用相对比较高,且杀虫种类的范围有限,因此,苏云金芽孢杆菌产品的需求价值为5千万美元,仅占全球杀虫剂市场的1%。最近,ICP基因导入农作物中,使其具有抗虫害能力。该项技术的发展,将会拓开苏云金芽孢杆菌产品的实用范围。这种抗虫害的转基因植物的应用,将排除了杀虫剂的稳定性的问题,也大大降低控制虫害的费用。如今,30多种农作物已转导成功,包括一些主要农作     

人神经营养素-3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

将人NT 3基因插入 pPAK9中后与Bsu36Ⅰ酶切的Bac6昆虫杆状病毒基因组DNA共转染sf2 1细胞 ,以空斑法分离重组病毒 .狭缝杂交、细胞免疫化学染色和背根节无血清培养证明NT_3整合入Bac6DNA中 ,表达并分泌至胞外 .2 0 0mL培养上清经CMSepharoseFastFlow纯化得到 2 0 0 μgNT_3纯品 ,其最大生物效应浓度为 4ng/mL .     

双拷贝v-cath基因的重组AcMNPV的构建与功能

利用AcMNPV穿梭载体Bac-to-Bac系统构建了分别由标状病毒极早期基因iel启动子和极晚期基因ph启动子控制的AcMNPV组织蛋白酶基因v-cath表达的两种双拷贝重组杆状病毒。用这两种重组病毒感染细胞主 幼虫,研究了不同时相v-cath基因的表达及细胞和幼虫死亡的机理。SDS－PAGE和Western blot分析结果表明：在感染Sf9细胞12h后（12hpi),重组病毒dciAcMNPV的晚期基因v-cath在早期基因iel启动了驱动下得到表达。到48hpi,重组病毒dcdAcMNPV中v-cath基因在晚期和极晚期ph启动子驱动下高水平表达,阴性对照v-cath缺陷型病毒（ncAcMNPV)则没有V－CATH蛋白表达。毒力实验表明它们的杀虫活性大小依次为dcdAcMNPV＞dciAcMNPV＞野生型AcMNPV＞ncAcMNPV。根据双拷贝重组病毒的毒力和幼虫的死亡特性,AcMNPV的v-cath基因是一个毒力辅助因子和与虫体液化死亡有关的基因。所构建的重组病毒dcdAcMNPV由于是通过改变病毒自身基因的表达时相和拷贝数而提高了杀虫效率,因而不存在田间释放时的安全性隐患,有望成为一种新型的病毒杀虫剂。     

分泌改善的重链促进基于蛋白内含子的双载体共转全长FVⅢ基因

在甲型血友病基因治疗中, 其疗效受FVⅢ的低分泌性和较大的FVⅢ基因难以为腺相关病毒(AAV)载体运载等因素的不利影响. 研究表明, 重链的分泌低下是导致FVⅢ分泌低效性的主要原因. 我们最近的研究表明, 应用蛋白质剪接技术的双载体转B区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)基因, 通过表达后重链和轻链的共价连接, 轻链可顺式促进剪接BDD-FVⅢ的分泌, 但重链分泌的低下影响分泌的水平. 本文将具有促进FVⅢ分泌作用的L303E/F309S点突变引入FVⅢ的重链, 通过蛋白质剪接的双载体共转断裂全长FVⅢ基因, 观察了重链和剪接全长FVⅢ的分泌和生物活性的变化. 构建了一对融合Ssp DnaB蛋白内含子(intein)的突变重链和轻链真核表达载体, 瞬时共转染培养的COS-7细胞, Western blotting结果表明转基因细胞有明显的剪接FVⅢ蛋白表达; 突变重链单独转基因后的分泌量为(39±11) ng/mL, 明显高于野生型重链的分泌量; 与轻链共转基因的重链分泌量增加到(123±13) ng/mL, 培养上清中分泌的剪接FVⅢ量和活性分别为(86±14) ng/mL和(0.61±0.08) IU/mL, 明显高于断裂的野生型FVⅢ共转基因. 另外, 转突变重链和轻链基因细胞的合并培养上清中亦检测到剪接的FVⅢ蛋白和生物活性, 且高于转野生型重链和轻链基因细胞的合并培养上清. 结果表明, 重链分泌性的改善可提高运用蛋白质剪接技术的双载体转断裂的全长FVⅢ基因的功效, 为动物体内进一步运用双AAV载体转全长FVⅢ基因提供了实验依据.