牦牛心脏原代成纤维细胞系的建立及鉴定

旨在建立牦牛胚胎心脏原代成纤维细胞系并对其进行鉴定.以牦牛胚胎心脏组织块为研究对象,运用组织块法对其进行分离培养获得原代细胞,使用胰酶消化法对原代细胞进行传代培养,通过MTT法检测细胞增殖活性,利用HE染色法及秋水仙素处理染色体鉴定细胞外形,选取4个成纤维标志性基因TGF-β、FSP-1、S100A4、Vimentin,通过RT-qPCR技术对基因的表达情况进行鉴定.结果显示成功将原代分离培养的成纤维细胞传代至11代;通过外型的一系列检测方法发现其符合成纤维细胞的外形,该细胞活力充足,生长规律符合“S”型生长曲线;荧光定量检测以上四种成纤维细胞特征性基因在不同代数中均表达且相对稳定,结果证实分离培养出的细胞符合成纤维细胞系的分子表达特征.本研究成功建立了牦牛胚胎心脏原代成纤维细胞系,集成了该细胞系的鉴定流程,为今后牦牛进一步研究提供相关的细胞系平台.     

Marc-145细胞库的建立及其生物学特性研究

从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)引进Marc-145细胞,建立了原始细胞库、主细胞库和工作细胞库,并对工作细胞库的细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性、微生物污染、核型、乳酸脱氢酶同工酶和对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)敏感性等特性进行了鉴定.结果显示,Marc-145细胞为上皮型细胞,生长状态良好,生长曲线呈"S"型,最大增殖浓度为4.71×105/mL,倍增时间为26.1h,细菌、真菌、支原体和红细胞吸附检测均为阴性,染色体核型为2n=60,对PRRSV敏感.建立的细胞,为开展猪繁殖与呼吸综合征病毒及其疫苗研究提供了细胞资源.     

人牙龈成纤维细胞的体外培养及生长曲线测定

目的:体外培养正常人牙龈成纤维细胞并测定其生长曲线,初步了解该细胞生物学特性.方法:用改良组织块法培养人牙龈成纤维细胞,通过MTT比色法研究细胞的生长曲线.结果:改良组织块法原代培养细胞成活率达80%,培养细胞呈梭形,从第3天呈对数生长,第4-5天进入平台期.结论:改良组织块法能简便快速地获得人牙龈成纤维细胞,初步了解其生物学特性.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

人工养殖下棘胸蛙的LDH同工酶冬眠前后的变化

利用聚丙烯酰胺垂直板电泳法,研究了平原地区人工养殖的棘胸蛙在冬眠前、中、后三个期间中,肝、肾、心、肌四种组织的乳酸脱氢酶酶谱,发现乳酸脱氢酶同工酶酶谱在不同组织中有差异,且在冬眠前后有一定的变化;初步探讨了季节对LDH同工酶的影响。     

DiI荧光标记示踪兔皮肤成纤维细胞修复前交叉韧带损伤的研究

体内采用组织工程方法构建前交叉韧带种子细胞筛选研究,提供了一种理想的细胞标记的方法.体外分离培养兔皮肤成纤维细胞(SF),比较皮肤成纤维细胞使用荧光染料CM-DiI体外标记前后细胞的生长状态、增殖活性以及检测SF复合纤维生物蛋白胶植入前交叉韧带上12周后的荧光表达情况.结果表明CM-Dil标记SF效果良好,标记阳性率高于95%.而标记前后SF增殖活性无明显变化,荧光标记在体内实验12周后仍有表达.从而证实CM-DiI是筛选前交叉韧带组织工程种子细胞筛选研究中细胞标记、示踪的良好标记物.     

黄鳝雌雄个体间LDH和EST同工酶的比较研究

用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术,比较分析了黄鳝雌雄个体间6种组织的乳酸脱氢酶(LDH)和酯酶(EST)的同工酶谱。结果表明:这两种同工酶仅在雌雄个体的肾和性腺中的表达同时存在显著差异;黄鳝和其它硬骨鱼一样,其同工酶的表达有明显的组织特异性。     

唐古特大黄细胞悬浮培养中的生理生化特性

目的 初步研究液体培养条件下唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)细胞的生理生化特性.方法 以唐古特大黄子叶为材料,诱导和筛选愈伤组织,进行细胞悬浮培养.测定了细胞悬浮培养过程中的细胞生长、pH值和总蒽醌累积的动态变化,并研究了水杨酸(SA)对细胞生长和总蒽醌累积的影响.结果 培养细胞生长周期36d;细胞的增殖曲线呈"S"形;其培养液pH值先下降后回升;细胞中总蒽醌累积规律也呈"S"形曲线,在培养的第30天,细胞中总蒽醌可达到最大值.SA对细胞的生长和总蒽醌累积有影响,0.1mg/L和1.0mg/L SA促进细胞的生长和总蒽醌的积累.结论 细胞悬浮培养过程中的总蒽醌累积和细胞生长呈正相关性.     

黑冀地鳖和中华真地鳖三种同工酶的比较研究

用聚丙烯酰胺垂直平板凝胶电泳法分析比较了新疆黑冀地鳖polyphaga obscurachop和中华真地鳖Eupolyphaga sinensis Walker的酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)三种同工酶的电泳酶谱,研究结果表明:两种地鳖各自具有不同的特征性酶谱;不同组织具有不同的特征性酶谱;酯酶(EST)同工酶的两种地鳖中的活性均较高,而乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的活性则较低.     

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定

目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.     

树(鼠句)(Tupaia belangeri chinensis)消化器官和性腺LDH同工酶的电泳分析

采用0.5%琼脂糖凝胶电泳方法对云南树鼩的肝脏、胃、小肠、胰腺、睾丸和卵巢组织的乳酸脱氢酶同工酶进行电泳分析.结果表明,在6种不同组中,乳酸脱氢酶均呈现为5种不同分子形式的同工酶.其LDH_4至LDH_1同工酶随电泳迁移率的增大依次趋于阳极端,LDH_5同工酶则趋于阴极端.按分光光度比色定量法对各同工酶组分进行洗脱定量,分别测得6种组织中5种同工酶组分的相对百分含量.通过酶谱分析,提示在6种不同组织中由于A、B两种基因表达活性的差异,其酶谱特征也各不相同.文中对树鼩6种组织的LDH同工酶的H和M亚基百分率及H/M亚基比率进行了统计分析,提示这与各类组织的生物学功能及代谢类型相关.     

隆线溞不同生殖状态下5种同工酶的活性比较

采用不连续垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,选取与隆线生长发育密切相关的5种同工酶:乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(M DH)、酯酶(EST)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)和细胞色素氧化酶(CO),比较分析了隆线溞在不种生殖状态下(孤雌溞、两性雌溞及雄溞)5种同工酶的表达差异.结果表明,隆线溞在3种生殖状态下,5种同工酶仅乳酸脱氢酶和酯酶呈现出酶带,这两种酶在孤雌溞和两性雌溞体内的表达变化基本一致,但乳酸脱氢酶雌溞、雄溞体内表达差异变化较大.其余3种同工酶的酶谱在隆线溞3种生殖状态下均不显著,可能是它们在隆线溞体内表达量很小,以至于活性较低.     

戴瑞奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定

乳腺上皮细胞系是研究动物泌乳调控机制的理想细胞模型。实验采用组织块培养法结合差时消化法,分离纯化了戴瑞奶绵羊乳腺上皮细胞,并通过细胞形态学观察、生长曲线测定、免疫荧光染色、特异性基因表达检测和细胞染色体数目分析等多种方法对细胞进行鉴定。结果表明,分离得到的乳腺上皮细胞呈典型的“铺路石形”或“多角形”,细胞生长周期符合一般生物学规律且细胞染色体数为2n=54;细胞稳定表达CK7、CK8和β-casein基因,免疫荧光染色实验也显示细胞表达CK7。本研究成功建立了戴瑞奶绵羊乳腺上皮细胞系,为奶绵羊泌乳调控机制的研究奠定了基础。     

西藏山溪鲵乳酸脱氢酶同工酶（LDH）的初步研究

采用聚丙烯酰铵胶电泳（PAGE）对西藏山溪鲵14种组织的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶谱系进行了研究，酶谱带在各种组织中的均表现为5带型，14种组织器官的LDH同工酶可分为三种类型：第一种为LDH1及H亚基占优势的，包括心肌，生殖腺，第二种为H基与M亚基7含量近乎相等的，包括皮肤，脾，肾等，第三种为LDH5及M亚基占优势，包括小肠，胃，肝，肺，肌肉，血清，眼 ，脑等，并将对西藏山溪鲵组织LDH同工酶种的特异性及组织特异性成因进行了初步讨论。     

3个地理种群蛤蚧不同组织同工酶分析

采用垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法,比较泰国、广西和越南地理蛤蚧(G ekko g ecko)种群的肌肉、心、肝、肺、胃、肠、性腺、肾等8种组织的乳酸脱氢酶(LDH)、酯酶(EST)和乙醇酸脱氢酶(ADH)同工酶。结果表明:广西种群和越南种群的LDH同工酶谱带在肌肉、心脏、肝脏、肺、胃和肾组织中完全相同,泰国种群各种组织中的LDH同工酶与广西和越南种群相比差异较大,主要表现在有较多的亚带,三个不同地理种群的8种组织几乎均表现出明显的5条LDH同工酶主带,但不同种群不同组织的谱带着色深浅不同;各组织EST同工酶谱无论从带型,谱带着色深浅来看,泰国种群均与其它两个种群差别较大;三个种群8种组织ADH同工酶的带型基本相同,迁移率也大致相同,但谱带着色深浅不同。     

Ⅱ型胶原诱导的关节炎大鼠滑膜成纤维细胞的培养、纯化和鉴定

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)病人滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)是研究RA发病机制和进行RA药物筛选的最理想的细胞来源.但是对于众多非医疗机构的高校和科研院所而言,由于RA病人滑膜组织不易获取而难以进行细胞水平的操作.因此,建立胶原诱导的关节炎大鼠(Collagen-induced arthritis,CIA)模型,成功分离膝关节滑膜组织并进行滑膜成纤维细胞的原代培养和纯化,将有效解决RA FLS的来源问题,为后续实验奠定基础.本实验通过皮内和皮下两次注射鸡Ⅱ型胶原诱导Wistar大鼠罹患关节炎,通过关节炎指数评分和膝关节HE染色明确CIA模型的建立;分离膝关节滑膜组织,采用Ⅱ型胶原酶和无EDTA胰酶消化法分离细胞并进行传代培养,传至第三代时,细胞免疫荧光检测细胞中VCAM-1蛋白含量以鉴定细胞纯度.结果显示,滑膜组织经过消化和培养后得到大量大鼠滑膜成纤维细胞;在显微镜下观察所得细胞呈梭形树突状,具有成纤维样细胞特征;VCAM-1蛋白阳性细胞达98%以上,确证所分离细胞为滑膜成纤维样细胞,且纯度极高.本研究建立了较简便快捷地获得大量滑膜成纤维细胞的方法,为RA的发病机制研究和药物防治提供了丰富的实验材料.     

一种胶原蛋白寡肽对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响

研究了罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽对体外培养人皮肤成纤维细胞增殖与Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响.采用WST-8法测定了胶原蛋白寡肽对人皮肤成纤维细胞增殖的影响,采用ELISA法检测了胶原蛋白寡肽对人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响.实验表明,罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽能促进人皮肤成纤维细胞增殖(P＜0.01),以及人皮肤成纤维细胞...     

黄河鲤和德国镜鲤及其杂种F1同工酶的比较研究

本研究用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，以亲本黄河鲤（ＣｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏＬ．（ＹｅｌｌｏｗＲｉｖｅｒｃａｒｐ））和德国镜鲤（ＳｅａｔｔｅｒｅｄＣｙｐｒｉｎｕｓＣａｒｐｉｏ．Ｌ．ｍｉｒｒｏｒ）及其杂种Ｆ＿１的肝脏、脾脏、心、肾脏、脑和肌肉为材料，进行了乳酸脱氢酶同工酶（ＬＤＨ），苹果酸脱氢酶同工酶（ＭＤＨ）和酯酶同工酶（ＥＳＴ）电泳图谱的比较分析，结果表明，同种鱼不同组织的同工酶谱有明显的组织特异性，亲本及Ｆ＿１的同种不同组织同工酶谱也有差异，亲本各组织的大多数同工酶在Ｆ＿１代得到表观，杂种Ｆ＿１的同工酶谱的表现又可分为三类：１）与双亲完全互补型；２）部分互补和少数亲本酶带消失型；３）产生双亲均无得以出现的酶带或杂种酶带型．本文还讨论了黄河鲤、德国镜鲤及其Ｆ＿１的同工酶的遗传基础和亚基组成．     

鲇和大口鲇同工酶比较研究

采用聚丙烯酰胺垂直平板凝胶电泳技术，对鲇和大口鲇的肌肉、心脏、肝脏、肾脏、脑、眼等6种组织器官乳酸脱氢酶（LDH）和酯酶（EST）同工酶进行了比较研究。结果表明：2种鲇的同种组织中乳酸脱氢酶（LDH）同工酶的酶谱相同，但在不同组织中表现出明显的组织特异性；而2种鲇的酯酶（EST）同工酶谱表现出明显的组织特异性和物种特异性。笔者还对2种鲇的亲缘关系进行了探讨。