苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中20-kb DNAs上染色体基因的鉴定

已有的研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株菱形晶体中含有与原毒素紧密结合的20-kb DNAs,利用PCR-RFLP分析发现在这些20-kb DNAs上含有cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab基因.本研究利用特异引物从4.0718菌株中20-kb DNAs上分别扩增出带有自身调控序列的cry1Ac和cry2Aa基因,并将其分别电转至Bt无晶体菌株Cry-B中获得重组菌株Cry-B(pHC42)和Cry-B(pHC39).SDS-PAGE和透射电镜分析表明这两种重组菌株能够分别产生由130-kDa的Cry1Ac原毒素形成的菱形晶体以及由65-kDa的Cry2Aa原毒素形成的方形晶体.毒力生测的结果显示,这两种菌株的表达产物对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有预期的杀虫效果.重组菌株分别形成的两种晶体经不同的缓冲液溶解后能释放出与20-kb DNAs紧密结合的原毒素,同时在20-kb DNAs上均可检测到源于Bt染色体的spo0A和nprA基因片段.     

苏云金芽胞杆菌高效电转化方法的建立

电转化已经成为苏云金芽胞杆菌工程菌构建过程中非常重要的一种外源基因导入方法.高效率的电转化方法将加速这类研究进展.通过对培养基、培养时间、感受态细胞制备、电转化缓冲液、电压参数的优化,建立一种高效的苏云金杆菌电转化方法.苏云金杆菌生长在含有0.5 mol/L山梨醇的BHI培养基中,30℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8,细菌细胞经1 g/L蛋白酶K在37℃处理20 min,然后用电转化缓冲液洗涤2遍,设定电压为1 800 V,电击1次.利用该方法,pHT315质粒在苏云金杆菌中的转化效率大幅提高.     

喂食Cry1Ac毒素对棉铃虫中肠类胰蛋白酶的影响

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在芽胞形成过程中产生的原毒素被敏感昆虫吞食进入消化道后,在中肠蛋白酶的作用下经历一系列酶的剪切活化过程,形成具有杀虫活性的毒性肽.类胰蛋白酶因其在昆虫中肠内蛋白质水解和Bt毒素活化中起着重要作用而受到广泛研究.本研究提取了棉铃虫4龄幼虫的中肠BBMV蛋白,利用SDS-PAGE分析鉴定到喂食Cry1Ac毒素24 h后,棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶的表达量呈明显下降趋势.该下降趋势很有可能是作为一种昆虫对Bt毒素作用的早期反应,通过影响Bt毒素在中肠中的酶解活化过程,从而为昆虫提供即时保护.     

人类新基因RMND5A的克隆及功能研究

克隆了一个新的人类Lish/CTLH结构域基因,经国际基因命名委员会批准命名为RMND5A.该基因位于染色体2p11.2,长3 239 bp,编码391个氨基酸,其结构域从N端起依次为LisH、CTLH与CRA.RT-PCR分析表明该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达,在心脏、肝和肾中的表达水平较强.对该基因的蛋白进行了表达并制备了多克隆抗体.荧光素酶活性测定分析表明,在COS7细胞中过表达蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子ELK-1和AP-1的转录活性显著下降,表明RMND5A通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.     

枯草芽胞杆菌ACCC-10619产芽胞条件的研究

通过单因素发酵试验和正交试验,确定了枯草芽胞杆菌ACCC-10619最佳培养基配方和发酵条件.结果表明最佳质量分数组合为:麸皮3.0%,葡萄糖3.0%,硫酸铵0.5%,硫酸锰0.05%,发酵温度33℃,初始pH为7.0,发酵周期36 h,静置时间12 h.经100 L发酵罐液体扩大培养,芽胞产量达8.5×1013个/L.为枯草芽胞杆菌微生态制剂生产应用提供参考.     

苏云金杆菌4.0718菌株InhA的鉴定和不同生长时期的表达分析

免疫抑制因子A (Immune Inhibitor A, InhA)是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)分泌的一种锌金属蛋白酶,具有水解昆虫抗菌肽的活性.为了研究InhA在Bt 4.0718菌株中的重要功能,利用SDS-PAGE分离了Bt 4.0718菌株营养生长中期、芽胞早期和芽胞晚期的细胞总蛋白质,通过MALDI-TOF/TOF MS分析以及数据库搜索,鉴定到了相对分子质量为86.5kD、pI为5.37的InhA蛋白质.然后采用双向电泳(2-DE)技术检测该蛋白质在不同时期表达量的差异,发现分离和鉴定到的InhA及相对分子质量为75kD、pI为5.13的InhA precursor蛋白质在营养生长中期的表达量比较高,说明InhA在营养生长中期前已开始形成,直到芽胞早期达最大表达量,但芽胞晚期的图谱分析和质谱鉴定均未发现InhA. InhA在营养期的高效表达说明:Bt进入昆虫体内后,InhA在Bt细胞生长繁殖初期表达,并抑制昆虫体内的抗菌肽对Bt细胞的裂解作用,从而有助于Bt在昆虫宿主中的生存,为芽胞期晶体和芽胞的形成以及菌株毒力的发挥奠定了基础.     

第三代测序细菌基因组DNA提取方法的比较

为筛选有效提取细菌菌株总DNA的方法,分别采用SDS法、CTAB-SDS法、试剂盒法和改良试剂盒法对苏云金芽胞杆菌、粘细菌和放线菌进行总DNA的提取、电泳检测、NanoDrop 2000测定、PCR扩增.对放线菌和苏云金芽胞杆菌,用改良试剂盒法所提取的总DNA纯度较高,电泳条带清晰,DNA主带位于23 kb,单位体积菌液所提取到的总DNA较SDS法和CTAB-SDS法高,能满足下游的PCR扩增等分子操作.对待测样品所做的质检报告也证实样品合格,可用于后续建库、测序.而粘细菌提取到的总DNA由于它们的OD260/230在2.0以下,没有达到第三代测序样品的要求.改良试剂盒法所提取到的总DNA大多数可以满足第三代测序技术样品制备的要求.     

一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其杀虫活性的研究

以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌菌株HX08为研究对象,通过菌落形态观察、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等进行菌体形态观察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定,该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis,命名为HX08,并将其16S rRNA基因序列提交上Genebank数据库,获得登陆号KF774302.通过生测发现,HX08菌株在60 h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好.对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行初步研究,建立了HPLC技术分离体系,使用H2O做流动相,以0.5 mL/min流速洗脱,检测波长分别为215、254和280 nm,收集第15 mL收集管处即保留时间为31 min的2号峰粗分离物活性较高.切取SDS-PAGE胶上相对应活性峰目的蛋白质条带酶解,利用质谱(LTQ-MS)技术进行了分子特性分析,鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶.     

转cry1Ab/Gc基因玉米的不同转化事件Bt蛋白表达和抗虫性分析

分析不同转化体Bt蛋白表达量和评估其抗虫性,进而筛选优异转化事件是转基因玉米新品种培育研究中的重要环节.为分析转cry1Ab/Gc基因玉米中Bt蛋白表达特性与抗虫性的关系,筛选优秀转化事件,研究以三个转化事件HG-1、HG-2、HG-3为试验材料,利用ELISA检测、玉米螟生测等技术,在室内和田间详细分析心叶期和抽丝期玉米抗虫蛋白表达量,并评估抗虫性.研究结果表明,同一转化事件不同组织或器官Cry1Ab/Gc蛋白含量存在显著差异,均表现为叶茎根;不同时期叶片Cry1Ab/Gc蛋白含量存在显著差异,表现为抽丝期心叶期;不同转化事件间,心叶期转化事件HG-1的叶片、抽丝期转化事件HG-1和HG-2的茎中Cry1Ab/Gc蛋白的含量明显高于其他材料.室内和田间亚洲玉米螟生测试验结果表明:不同转化事件抗虫性差异显著,转化事件HG-1在心叶期和抽丝期亚洲玉米螟抗性显著高于其他两个玉米转化事件,与该时期Cry1Ab/Gc蛋白高表达的试验结果一致.本研究结果证实不同玉米转化事件Bt蛋白表达量显著差异,心叶期和抽丝期Bt蛋白表达量与亚洲玉米螟抗性呈正相关,可以作为抗虫转基因玉米优秀转化体初步筛选的重要技术指标,具有可操作性强、技术稳定性好、节省时间等优势,为抗虫转基因玉米新品种培育研发提供数据参考.     

药用植物蚬壳花椒的离体培养及再生体系的建立

为了研究蚬壳花椒的离体培养并建立再生体系,用蚬壳花椒的二年生植株的幼茎作为起始外殖体,接种在含不同激素的MS培养基上,结果为最佳腋芽诱导培养基为:Ms+2.0 mg.L-16-BA+O.05 nag.L～1NAA,诱导率达64.O%;最佳丛生芽诱导培养基为:MS+2.0 mg.L-1ZT+0.2 mg.L-1NAA,诱导率达90.O%;最佳增殖培养基为:MS+6.BA0.5 mg.L-1+NAAO.05rag.L-1+生物素1.0 mg.L-1,增殖系数可达到4.O;最适生根培养基为:1/3MS+IBAO.3mg.L-1+NAA O.05 rag.L-1,生根率达78%.     

三蕊柳的组织培养及快速繁殖的研究

以三蕊柳的休眠芽为材料,进行了萌动芽的生长,不定芽的分化,试管苗的继代培养与留茬培养,生根苗扦插和移植的研究,成功地建立起三蕊柳快速繁殖技术.研究结果证明:MS+BAO.1mg·L-1 +GA 1.0 mg·L-1+ IAA0.2mg· L-1是休眠芽生长培养的理想培养基;1/2MS+BA 0.6 mg·L-1+ IA...     

光催化净水器的研制和应用

将负载二氧化钛的铝片装填于PVC管内壁,自制一台小型的光催化净水器,并取自海口的不同水样进行了催化降解和灭菌处理.经处理60 min后,自来水CODMn由O.18 mg·L-1降低为0.10 mg·L-1,去除率为44.44%,细茵数由6.66个·L-1降低为0,灭茵率为100%;红城湖水CODMn由43.3 mg·L-1降低为33.9 mg·L-1,去除率为21.69%,细茵总数由5.60xlO12L-1降低为5.20×106 L-1,灭菌率为99.99%;南渡江水COD‰由26.1 mg·L-1降低为17.6 mg·L-1,去除率为32.51%,细菌总数由2.22×109 L-1降低为4.30×104 L-1,灭菌率为99.99%.结果表明净水器有显著去除有机物和灭菌的能力.     

人类新基因ZNF322的研究进展

根据计算机克隆的ZNF322基因序列设计引物,从人类胚胎心脏文库中克隆了ZNF322基因.该基因位于染色体6p22.1,编码由402个氨基酸残基组成、含有9个连续排列的C2H2型锌指蛋白质.Northern杂交的结果表明该基因在成人所有被检测组织中表达。亚细胞定位研究证明ZNF322蛋白分布在胞核和胞质中.报告基因分析显示ZNF322是一种潜在的转录激活因子.     

鳜肌球蛋白轻链2基因cDNA的克隆及其发育表达分析

通过构建肌肉组织cDNA文库分离到鳜肌球蛋白轻链2基因(MLC2),基因登录号为FJ428249.MLC2基因cDNA序列全长1 206 bp,编码区长度为579 bp.MLC2基因开放阅读框编码170个氨基酸,具有EF-手相家族蛋白全部4个EF-手相结构.与已报道的其他动物MLC2相比较,所推导氨基酸序列同源性在66.3%～97.6%,其中与ca2+结合区域非常保守,7种鱼氨基酸序列同源性为100%.采用实时荧光定量PCR方法对鳜MLC2发育表达分析表明,MLC2在原肠期开始有低量表达,与原肠期相比,尾芽期、肌肉效应期和仔鱼阶段MLC2表达量随发育阶段渐进而升高.     

移动床生物膜反应器处理回用PVC母液废水

采用新型球状聚丙烯悬浮填料,应用好氧移动床生物膜工艺生化处理PVC母液废水。反应器在三周内完成启动,并对比了两种启动方式的生物膜量和COD去除效果,为工业化试验提供了依据。在载体填充率20%,进水COD 100 mg.L-1~300 mg.L-1,浊度60 NTU~100NTU,气水比(10~15)∶1,有机负荷0.16 kg COD m-3.d-1~0.56 kg COD m-3.d-1,水力停留时间14 h的条件下,出水COD可降到20 mg.L-1以下,浊度平均达到10 NTU,TOC去除率可达到90%,对氨氮也有较好的处理效果,出水能满足到工业循环冷却水要求。     

人类新基因RHBDL8的研究初报

运用计算机克隆的方法获得了一个新的人同源基因，经国际基因命名委员会批准命名为Rhomboid，veinlet-like8(RHBDL8)．该基因位于7号染色体q11．23区域，mRNA全长约1．8kb，3’末端含有ATAAA的加尾信号，编码一段长434个氨基酸的蛋白质．该蛋白质含有一个rhomboid保守区，且高度相似于一个未有研究的小鼠蛋白．其表达在胚胎期(23周)主要集中在大脑、心脏、骨骼肌，而在成体，除脑部依然有大量表达外，上述的其他部位表达量均大大降低．这种在发育过程中的表达变化提示我们该基因可能在这些器官的发育中起到了一定的调控作用．     

环丙沙星荧光光度法测定镓(Ⅲ)

研究了环丙沙星荧光法测定镓(Ⅲ).在pH 4.5的HAc-NaAc缓冲溶液中,镓(Ⅲ)与环丙沙星反应,使体系荧光强度增加,体系最大激发、发射波长分别为373.0 nm和449.0 nm,镓(Ⅲ)测定的线性范围为1.25×10-6 ～6.48×10-3 mol.L-1,检出限为5.44 ×10-7mol.L-1.对1.00 ×10-5 mol.L-1的镓(Ⅲ)平行测定(n=11),其相对标准偏差为1.5％.方法用于粉煤灰样中镓(Ⅲ)含量的测定,分析结果与AAS法测定结果吻合.     

簸箕柳组织培养初步研究

对簸箕柳组织培养技术进行了初步探索.结果表明:以簸箕柳嫩枝条为外植体,消毒以70%(体积分数)乙醇30～40 s+0.1%(质量分数)HgCl24～5 min为宜;用White为基本培养基,激素组合以6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1诱导腋芽效果最好;BA对腋芽的诱导率有显著影响,回归方程为Y=29.806+126.517X-64.522X2;基本培养基对丛生芽的诱导无明显影响;不加激素的White和B5培养基均可诱导无菌苗生根.     

LBM2eHBc＋融合基因植物表达载体构建及对番茄的转化研究

禽流感病毒一直是家禽和家畜健康养殖的巨大威胁,甚至威胁着人类的健康,人们也一直在研究各种形式的疫苗来应对禽流感病毒的威胁.番茄作为生物反应器应用于动物疫苗生产具有独特的优点,本研究优化了番茄子叶的再生体系,同时构建了LBM2eHBc＋融合基因的植物表达载体并对番茄进行了遗传转化.结果表明在玉米素（Zt）浓度为0.5 mg/L时番茄子叶外植体的芽再生率达到93.33%;测序结果证明植物表达载体pBI121-LBM2eHBc＋构建成功;利用农杆菌介导的转化方法获得再生抗性苗34株,经PCR检测,阳性率为75.0%,本研究结果为进一步开发禽流感口服疫苗奠定了基础.     

半夏乙醇提取物对桃蚜的控制作用研究

选用无水乙醇为有机溶剂,采用索氏提取法提取半夏干粉中的活性物质,研究提取物对桃蚜的控制作用.结果表明,半夏乙醇提取物对桃蚜有较好毒杀活性,提取物浓度越高,效果越明显,当浓度为100.0mg·mL^-1,处理后48h,毒杀校正死亡率在90%以上.桃蚜在半夏无水乙醇提取物处理过的叶片上取食,其若蚜发育历期延长,成蚜寿命显著缩短,生殖力显著下降,桃蚜种群数量受到明显的抑制,在浓度为100.0mg·mL^-1时,7d后桃蚜种群数量约为对照的47.6%.