流感病毒RNA聚合酶重组质粒pQE32-PB2-1转化效率的实验研究

目的:甲型流感病毒RNA聚合酶PB2-1亚基的基因工程重组质粒pQE32-PB2-1转化入受体菌,并优化转化条件,以建立其高效、快速的转化体系.方法:以大肠杆菌DH5α菌株为受体菌,研究了氯化钙溶液浓度(25、50、75、100mmol/L),热休克温度(30、37、42、50℃),转化时间(15、30、60、75min)及热休克作用时间(60、80、100、120sec)对基因工程重组质粒pQE32-PB2-1转化效率的影响.结果:氯化钙溶液浓度、转化时间、热休克温度、热休克作用时间对转化效率的影响有统计学意义(P<0.05).氯化钙溶液浓度和转化时间之间及热休克温度和热休克作用时间之间分别存在交互作用.结论:在本实验条件下,以75mmol/L氯化钙制备感受态细胞,转化60min,经42℃热休克作用120秒后直接涂平板选择转化子,可获得高效、快速的转化效果.     

CaCl2浓度对感受态细胞转化效率的影响

对于E.coli菌株用8种不同浓度的CaC l2制备感受态细胞,然后转化各浓度的感受态细胞。实验结果表明,不同浓度CaC l2溶液处理所得到的感受态细胞,其转化效率有很大的不同。随着CaC l2浓度增高,转化效率也随之提高,在80m mol/L~100m mol/L时达到峰值,进一步提高CaC l2的浓度,转化效率急剧下降。还探讨了-70℃贮存时间对转化效率的影响。     

三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化

描述了一种改良的高效细菌感受态的制备和感受态细胞的保藏及细菌的转化方法.三种不同的大肠杆菌分别是DH5α,TG1和XL1blue,其中最有效的是XL1blue.每种菌株的感受态细胞制备的最佳光密度(OD600值)不同.对感受态细胞的存储时间及其与转化效率之间的关系也进行了研究,结果显示感受态细胞可以在-20℃存储7d,在-70℃存储15d.将常见的方法做了三种改进:首先是将CaCl2溶液改为TB溶液;其次是将培养基由LB换成S.O.C;再就是在质粒对感受态细胞的转化过程中加入DMSO或PEG8000.改良的细菌转化系统比常见的方法能提高转化效率约1000倍,是一种高效的细菌转化系统.     

感受态细胞制备和质粒转化冰浴时间对大肠埃希菌转化效率的影响

通过研究转化实验中加入质粒DNA的量、大肠埃希菌感受态细胞制备和质粒转化过程中冰置时间长短对感受态细胞最终转化效率的影响,分析其最佳转化效率参数,优化感受态制备和转化方法.结果表明,加入质粒（pBR322）DNA量为1～10ng,感受态制备过程中菌液冰浴时间在30～60min,以及感受态细胞加入质粒DNA并混匀后的冰置...     

大肠杆菌JM109菌株高效电转化条件的研究

通过感受态细胞的生长状态、转化温度及不同的电击杯内径、电压等影响电转化的重要条件,探讨索了大肠杆菌JM109菌株电转化的最优条件.在感受态细胞OD600值为0.5-0.7,转化环境温度为4℃,电容25 μF、并联电阻200 Ω、电压2.5 kV和0.2 cm电击杯电转化效率最高,可达到9.12×108.     

H_2O_2处理对采后樱桃番茄和芒果抗冷性的影响

为了探讨解决冷敏型樱桃番茄(Lycopersicum esculentum Mill.Var.cerasiforme)、芒果(Mangifera indica L.)冷藏中的冷害问题,用0.001 mmol/L、0.010 mmol/L、0.100 mmol/L过氧化氢(H2O2)和冷激、热激对樱桃番茄和芒果处理后,在2℃冷藏中观测了冷害发生情况、色度及果实中H2O2和丙二醛(MDA)含量.结果表明,樱桃番茄H2O2 0.100mmol/L处理、芒果H2O2 0.001 mmol/L处理比对照蒸馏水处理具有较低的冷害发生率、冷害指数、H2O2和MDA含量,樱桃番茄的色度值也高于对照处理.对樱桃番茄减轻冷害的效果与冷激和热激处理效果相当,对芒果的效果与冷激处理效果相当.冷藏前用H2O2溶液处理可以提高樱桃番茄和芒果冷藏中的抗冷性,减轻冷害.     

海洋酸化影响重金属Cd对石莼的生理学毒性

以石莼(Ulva lactuca)为研究对象,探究不同CO2(390×10-6和1 000×10-6)和Cd2+(0 mmol/L、0. 05mmol/L和0. 10 mmol/L)浓度对大型海藻石莼光合生理的耦合效应.结果表明:随着Cd2+浓度增加,石莼的相对生长速率、净光合速率、光反应中心II最大光能转化效率和实际光能转化效率,与对照组(0 mmol/L)相比,均显著降低,且在CO2浓度升高的条件下,这种负面效应更加显著. Chla、Chlb和Car含量在Cd2+浓度升高时明显降低,对Cd2+和CO2的交互作用影响的敏感度为:Chla Chlb Car. Cd2+和CO2对胞外碳酸酐酶存在明显的交互作用,而CO2浓度升高使酶活性下降更明显.以上结果表明,海洋酸化加剧了Cd2+对石莼的生理学毒性作用.     

光合菌群利用丁酸产氢的初步研究

对影响光合茵群利用丁酸产氢的主要因子:初始细胞浓度、温度、初始pH值、光照强度和丁酸浓度进行了研究.结果表明,光合茵群在初始细胞浓度0.2～O.3 g/L,温度30~40℃,PH 6.0～9.0,光照强度2000～8000 Lx,丁酸浓度6～30 mmol/L的范围内均可以保持较高的产氢效率.当初始细胞浓度为0.3 g/L、温度30℃、初始PH 7.0、光照强度为4000 Lx、丁酸浓度为30 mmol/L时该光合茵群具有最大产氢量364 mL,最大产氢效率5.4 mol-H_2/mol-丁酸和最大产氢速率22.2 mL/L/h.     

一种改良的DNA沉淀法在重组DNA转化大肠杆菌中的应用

以构建pUC18-EGFP载体为例,通过对DNA连接产物进行沉淀处理,对普通的DNA沉淀法进行了改良.实验证明,采用改良的DNA沉淀法处理后的连接产物,转化大肠杆菌的效率约是对照组的10倍,并且大肠杆菌感受态细胞用量减少到10μL.这一改良的DNA沉淀法用CaCl_2替代TE作为溶解沉淀DNA的溶剂,省略了用70%乙醇洗涤DNA沉淀的步骤,较普通的DNA沉淀法操作起来更为简便.     

高效电转化率条件的探索

对影响ＤＮＡ电转化效率的主要因素进行探索,结果表明：在相同的电场强度、电阻入电容条件下,电中时间的长短对电转化交谊级较大影响,电脉冲时间太长或太短均使转化效率降低;用对数生长早中期的细菌制备感受态细胞,经液氮速冻后储存于－７０℃,能获得高转化效率。     

Red重组系统介导下大肠杆菌改造体系的优化

对Red重组系统介导下大肠杆菌进行遗传改造的转化条件、诱导条件、复苏条件三方面实验参数进行优化研究。结果表明:电转化加入的DNA为20ng,Red重组系统感受态细胞培养浓度为OD600=0.60,所需的电击感受态细胞数为3×108;对大肠杆菌基因做双敲除时,突变第2个基因的阿拉伯糖诱导最适时间比突变首个基因延长,诱导浓度为40μm,复苏时间变化对体系影响不显著。     

Microbial Transformation of Acetophenone to 2—Phenylethanol

Microorganisms are commonly used to transform chemicals to chiral compounds. Pseudomonas cepacia 1813, Pseudomonas stutzeri 1317, Saccharomyces cerev isiae 1912, and 5 Escherichio coil strainswere used to transform acetophenone to 2-phenylethanol. The results show that the E. coli strains have the poorest biotransformation ability. P. stutzeri 1317 provides the best transformation ability with a transformation rate of 30% achieved with either whole or broken P. stutzeri 1317 cells for a reaction pH of 8. 2 and an initial acetophenone concentration of 2 g/L. An acetophenone concentration of 10 g/L strongly inhibits the biotransformation for a pH of 8. 2. Crude alcohol dehydrogenase obtained from S. cerevisiae 1912 transforms acetophenone to 2-phenylethanol when nicotinamide adenine dinucleotide reduced (NADH) is added.     

枯草芽孢杆菌高效转化及其转化子验证方法

用构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB600感受态细胞,进行不同时间预培养后,涂布于抗生素平板培养,研究一种更高效的转化方法。用载体与外源片段的连接产物转化WB600感受态细胞,进行最佳预培养时间培养后,涂布于抗生素平板培养,培养得到的转化子用PCR快速验证和双酶切鉴定,研究一种转化子的快速验证方法。     

大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率的改进

针对实验材料E．coli DH5α,对该菌株在不同生长时期的转化效率进行测定,确立了一个能制备高转化率感受态细胞的实验方案．结果表明：在细菌的生长繁殖过程中,其转化率有很大变化;得到了E．coli DH5α菌株制备感受态细胞的最佳条件．     

大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的原生质体融合

本文对大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）的原生质体融合进行了研究，获得了融合菌原生质体的再生，根据两种菌的形态和利用淀粉的能力上存在的明显差异，对融合菌的原生质体进行筛选，实验结果表明，融合细胞具有降解淀粉的能力，但不形成芽胞。     

His-tag标记的嗜热菌来源L-脯氨酸脱氢酶的纯化与性质

以引入了His-tag做标记的超嗜热菌Thermococcus profundus色素依存性L-脯氨酸脱氢酶基因片段为目的基因,在宿主大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)CompetentCells中表达目的蛋白。细胞培养液经超声菌体破碎、热处理、NiSepharose层析分离,得到纯度较高的His-tag色素依存性L-脯氨酸脱氢酶,比酶活是纯化前的5倍。纯化后的酶液经凝胶电泳分离得到片段为58600,40200,22300的3段短肽。通过对该酶性质的初步探索,得出在温度50℃,体系pH8.0,300mmol/LTris缓冲溶液的条件下,L-脯氨酸脱氢酶酶活最高,为1.5U/mL。     

大肠杆菌O157中肽聚糖水解酶MpaA的克隆、表达、纯化及晶体学研究

采用分子克隆方法将来源于大肠杆菌O157的mpaA基因构建入pET-21b(+)表达载体.诱导MpaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,通过Ni亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析三步法纯化得到高纯度蛋白.使用气象扩散法进行蛋白质晶体生长的初步筛选与优化,得到MpaA蛋白质单晶,并使用X射线衍射仪进行衍射数据的收集与处理.MpaA晶体分辨率为0.26 nm,属于P31空间群,晶胞参数为a=5.989 3 nm,b=5.989 3 nm,c=12.987 0 nm,β=90.000 °.MpaA晶体衍射数据的收集为后续结构解析和催化机制的阐明提供了基础.     

耐盐细菌质粒的研究

本实验以1株耐盐细菌My23（耐18％NaCl）作为研究对象,采用碱裂解法对其进行质粒提取,结果表明可以提取得大小2个不同质粒;改变常规提取方法中的部分环节,如加入STE清洗菌体的培养基成分,溶菌酶的使用,以及加入碱裂解液Ⅰ后静置20min,对该耐盐菌质粒的提取有较好的作用。经SDS法将小质粒消除后的菌株与野生型菌株的耐盐功能比较,发现提取出的小质粒与耐盐无关。将大肠杆菌DH5α制备成感受态细胞,将耐盐菌的质粒进行转化,结果进一步表明耐盐性状与质粒没有关系。     

白及多糖提取工艺及抑菌活性检测

以水提醇沉法提取白及多糖,以不同料液比、提取温度和提取时间作为实验条件,以白及多糖提取率为指标进行正交实验,从而确定最佳的提取工艺.在最佳条件下将提取得到的白及多糖以合适的用量和添加方式加入到膏剂中制成白及膏.采用滤纸片扩散法测定白及多糖提取液和白及膏对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制作用.结果表明,白及多糖最佳提取工艺为料液比1∶35（g∶mL）,提取温度80 ℃,提取时间4.0 h,在此提取条件下,白及多糖得率为25.97%.当质量浓度达到0.33 g/mL时,白及多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用;当质量浓度提高至0.66 g/mL时,白及多糖提取液抑菌效果较强,对大肠杆菌的抑菌效果优于市售的一夫百应抑菌膏.白及膏性能稳定,对大肠杆菌抑菌效果强于金黄色葡萄球菌.