八肋游仆虫NMD途径因子的生物信息学分析及分子鉴定

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是细胞内基因表达调控的一种重要方式,以保障细胞内基因的精确表达,但无义mRNA被识别和降解的机制有待深入研究。文章利用同源序列比对,从八肋游仆虫大核基因组数据库中鉴定了11种NMD途径相关蛋白因子的基因序列,并预测了各个蛋白因子的功能结构域;利用蛋白质三级结构预测与分子对接技术,分析了八肋游仆虫eUPF1-CH与eUPF2-U1BD之间相互作用的关键氨基酸残基。利用定点突变和Pull-down实验证实,eUPF2可能通过其保守的αA-helix结构域与eUPF1相互作用。     

八肋游仆虫中心蛋白的核磁共振研究

利用液体核磁共振方法对八肋游仆虫中心蛋白全长蛋白(EoCen),LC端结构域(EoCen-LC)和N端结构域(EoCen-N)进行了分析,并研究了蛋白与钙离子的相互作用情况.研究结果表明,未加入钙离子,全长蛋白,LC端结构域和N端结构域谱图重叠严重,峰型较差,说明未折叠成良好的三级结构,存在较大的构象交换或一定程度的聚集;与钙离子结合后全长蛋白,LC端结构域三级结构有所改善,但仍然无法用液体核磁共振方法进行进一步的结构研究.N端结构域与钙离子结合后谱峰分散性好,说明N端结构域具有较好的三级结构,能够应用核磁共振的方法进行结构解析.     

八肋游仆虫信息素在大肠杆菌中的表达

信息素在八肋游仆虫接合生殖过程中起着重要的诱导配对作用，为了进一步研究其诱导机制，根据已知的基因序列，应用PCR技术，扩增信息素G3基因，并将该基因插入表达载体pGEX-6P1中，构建了重组表达质粒pGEX-6P1-G3．重组菌在37℃下，经1．0mmol／L IPTG诱导，12％SDS-PAGE分析，在37kDa处出现明显的特异目的带。     

八肋游仆虫蛋白激酶A的克隆及原核表达分析

为了研究低等真核生物中蛋白激酶PKA(cAMP-dependent protein kinase A)的生物学功能,以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)为实验材料,通过生物信息学方法分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,发现八肋游仆虫中编码蛋白激酶PKAc(PKA催化亚基)的基因只有一种。通过PCR扩增获得游仆虫PKAc基因(EoPKAc),分析表明EoPKAc基因全长1158bp,不含有内含子,开放阅读框981bp,编码326个氨基酸。序列比对结果显示EoPKAc含有与其它已知蛋白激酶相同的11个亚结构域(subdomain)以及一些重要的保守氨基酸。构建原核表达质粒pGEX-6P-1-PKAc,转化至大肠杆菌BL21中,EoPKAc获得高效表达,经GST柱亲和层析后获得较高纯度的EoPKAc蛋白,表达产物经Western blotting检测为阳性。     

八肋游仆虫核糖体蛋白P1A磷酸化位点分析

为了探讨单细胞真核生物八肋游仆虫酸性核糖体蛋白P1(EoP1)的磷酸化作用,对EoP1的一个亚型EoP1A进行了磷酸化位点分析。通过在线软件预测EoP1A的磷酸化位点,根据预测结果进行定点突变,随后对EoP1A野生型及突变体分别在大肠杆菌中进行了表达纯化。利用核磁共振(NMR)检测EoP1A的体外磷酸化作用,结果表明位于蛋白N端的第8位丝氨酸(Ser8)为CK2磷酸化EoP1A蛋白的磷酸化位点。     

八肋游仆虫中心蛋白与铕离子相互作用的电化学研究

使用电化学阻抗法(EIS)和循环伏安法(CV)研究了野生型八肋游仆虫中心蛋白(EoCen)在玻碳电极表面的吸附特性及EoCen与Eu3+的相互作用过程。研究发现EoCen在电极表面的吸附不受电极电势的影响;EoCen与N端中心蛋白(N-EoCen)的吸附性相比,吸附速率相近,吸附自由能相近。CV和EIS滴定实验都证明Eu3+与EoCen形成了配位比为4∶1的配合物。并且滴定曲线能够区分EoCen上的四个金属离子结合位点,与使用光谱方法不能有效区分这四个位点相比,电化学方法更具优势。     

八肋游仆虫中ECD1基因的克隆及序列分析

含有CHROMO(chromatin organization modifier)结构域的蛋白参与了异染色质的形成及转录沉默复合物的形成.原生动物游仆虫细胞中既含有转录活跃的大核也含有转录沉默的小核.本实验应用PCR技术从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中获得了一个编码含有CHROMO结构域的基因ECD1(Euplotes chromo domain-con-taining protein 1)(GeneBank登录号为FJ357578).大核中含有该基因的微小染色体全长1105 bp.小核中该基因内无内部删除序列IES的存在.通过RT-PCR,证实该基因开放阅读框为645 bp.大核基因中含有三个内含子,转录过程中这些内含子均符合一类内含子GU-AG剪切规则.DNAstar软件分析,该基因编码的蛋白质包含214个氨基酸,分子量24.7 kDa,等电点为5.48.结构域聚类分析表明Ecdl蛋白可能执行与四膜虫异染色质蛋白Pddlp和Pdd3p相似功能,参与大核发育过程中异染色质的形成和IES序列的删除.     

八肋游仆虫组织蛋白酶B-1的克隆、表达和性质分析

为研究八肋游仆虫中组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的生物学功能,选用组织蛋白酶B-1(EoCTSB-1)为研究对象,通过PCR扩增获得EoCTSB-1的基因。利用生物信息学软件分析表明八肋游仆虫CTSB-1基因全长为980bp,不含有内含子,开放阅读框为862bp,编码286个氨基酸。氨基酸序列比对分析显示八肋游仆虫中组织蛋白酶B-1具有保守的催化活性位点,但缺少信号肽和封闭环结构。构建重组表达质粒pET30a-EoCTSB-1,并转入原核细胞中表达,经镍柱亲和层析以及变复性处理后获得较高纯度的EoCTSB-1蛋白,表达产物利用His-Tag的抗体进行western印迹检测,结果显示阳性。利用底物Z-Phe-Arg-AMC测得EoCTSB-1的最适温度为35℃,最适pH是5.0。     

八肋游仆虫ARF1蛋白的表达纯化及其与嘌呤核苷酸的相互作用

ADP核糖基化因子1(ARF1)是Ras超家族的成员,调控细胞内囊泡运输,进而影响细胞的生长发育。为了研究单细胞真核生物八肋游仆虫ARF1的功能,构建了重组表达质粒pET28a-ARF1,在大肠杆菌BL21中进行了表达纯化,获得高纯度的八肋游仆虫腺苷酸核糖基化因子1蛋白EoARF1,随后通过荧光光谱法检测了其与嘌呤核苷酸的相互作用。结果表明,表达纯化的EoARF1蛋白能与嘌呤核苷酸发生相互作用,其结合位点数n约等于1,且与鸟嘌呤核苷酸作用强弱顺序为GTPGDPGMP,与GDP的结合强度明显大于与ADP的结合强度。     

八肋游仆虫一个新β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

从八肋游仆虫细胞中克隆到一种新的β-微管蛋白基因.序列分析结果表明:在大核中,该基因全长1561bp.与已经报道过的β-微管蛋白基因不同,它的5′端基因上游调控序列有49 bp,AT含量为75.5%.上游调控序列中仅有一个TATAA框,没有CCAAT框;该基因的3′端的下游调控序列有121 bp,富含AT碱基,达到86.8%,其中有明显的反向重复序列.上下游调控序列中各有一个断裂信号TTGAA和TTCAA,负责从小核到大核发育过程中大核染色体的形成.从小核基因组中克隆到相应的基因片段,比大核中的序列多7个碱基5′-CATGCTC-3′,其功能尚不清楚.序列比对表明,新的β-微管蛋白基因与已经报道的β-微管蛋白基因的同源性92.3%,阅读框中有2个氨基酸的变化,将它命名为β2-微管蛋白基因.     

八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子金属离子结合性质的光谱研究

Ca~(2+)在中心蛋白调节许多生理过程并发挥生物功能中起到很重要的作用.本文分别使用TNS、Tb~(3+)为荧光探针研究了八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子(P_(12))与不同稀土离子的结合性质及对其构象变化的影响和P_(12)与Tb~(3+)结合的热力学性质.结果表明,在pH 7.4、0.01 mol/L Hepes条件下,中心蛋白与稀土离子结合的稳定性和稀土离子饱和的蛋白质疏水区暴露程度与稀土离子静电势成正比;稀土离子主要以静电作用占据八肋游仆虫中心蛋白N-端区域的金属离子结合部位.     

八肋游仆虫小核中Rab1家族基因的分离及多态性分析

从八肋游仆虫小核中克隆筛选到7种E orab1基因,它们的同源性为94.5%~98.6%.将这7种小核E-orab1的M DSs(m acronuclear destined sequences)在NCB I网站进行BLA ST比对,发现7种小核E orab1的M DSs的四种M DSs序列有相对应的大核E orab1家族基因,据此4种小核E orab1依次命名为m iE orab1b,m iE orab1 ik,m iE orab1n,m iE orab1c.研究表明,大核中R ab1家族基因的多态性部分或全部来源于小核R ab1家族基因.     

八肋游仆虫CK2α-1基因的表达需要+1位编程性翻译移码

酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)在细胞周期,细胞增殖与细胞生长,细胞生存和细胞死亡过程中起着十分重要的作用。为了研究单细胞真核生物中CK2的结构与功能,我们通过分析八肋游仆虫转录组数据得到了七个CK2编码序列,包括四个α亚基和三个β亚基序列。以大核基因组和cDNA为模板对七个基因进行了扩增与鉴定,将其分别命名为EoCK2α-1,EoCK2α-2,EoCK2α-3,EoCK2α-4,EoCK2β-1,EoCK2β-2和EoCK2β-3。序列分析表明EoCK2α-1需要发生+1位的编程性翻译移码,利用在酵母中研究编程性翻译移码的双荧光素酶报告检测体系对EoCK2α-1移码率进行了研究。     

近亲游仆虫接合生殖的研究

应用蛋白银染色方法和扫描电子显微镜技术研究了近亲游仆虫的接合生殖过程。并对接合生殖过程中皮层的两次演化,大、小核的不同变化,新、老结构的关系和老结构的命运等进行了讨论。     

卡龙游仆虫分类地位的研究

利用蛋白银、孚尔根和银浸等染色方法对Ｅ．ｃｈａｒｏｎ的形态结构、形态变异性及分类地位进行了研究．Ｅ．ｃｈａｒｏｎ表面有额腹、横、尾部棘毛１０、５、４根,背触毛１２列,相邻两背触毛之间有两排银线网格,大核倒Ｃ形,小核球形。随机抽取１００个Ｅ．ｃｈａｒｏｎ,对其长,宽、棘毛数、背毛列进行统计,做出直方图进行分析,并与Ｅ．ｐａｔｅｌｌａ做详细比较,作认为Ｅ．ｃｈａｒｏｎ应独立的为一个种。     

近亲游仆虫接合生殖的研究

应用蛋白银染色方法和扫描电子显微镜技术研究了近亲游仆虫的接合生殖过程.并对接合生殖过程中皮层的两次演化,大、小核的不同变化,新、老结构的关系和老结构的命运等进行了讨论.     

重组慢病毒介导的NMD途径因子UPF1和SMG1可诱导干扰细胞株的构建

无义介导的mRNA降解途径是一个比较完善的异常mRNA的降解机制,结合在外显子拼接复合体上的多种蛋白决定NMD途径对异常转录物的识别和降解的启动,其中UPF1和SMG1发挥主要功能.UPF1是一个RNA解旋酶和RNA依赖的ATP酶;而SMG1具有磷脂酰肌醇激酶活性,负责UPF1的磷酸化.本研究构建了含有UPF1和SMG-1基因发夹结构的诱导开关基因表达干扰质粒.利用慢病毒介导转化哺乳动物细胞HEK293T细胞得到重组病毒,经鉴定后感染细胞AD_293,目的基因在细胞中得以高效表达.通过继代培养和单克隆化,得到强力霉素诱导干扰UPF1和SMG-1表达的稳定细胞株.     

八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRFla多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

将八肋游仆虫第一类肽链释放因子基因eRFla克隆入表达载体pRSETc,并在大肠杆茵B121(DE3)中进行诱导表达.表达形成的包含体经切胶回收,然后免疫大鼠制备抗血清.所获得的抗血清用Amersham Biosciences抗体纯化试剂盒进行纯化,SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的抗体纯度很高.Western blotting印迹和ELISA鉴定结果表明抗体特异性好,效价为1 5 000.     

小腔游仆虫形态和形态发生的研究

本工作主要采用蛋白银染色技术对小腔游仆虫形态和形态发生进行了描述和研究，从银线系角度及发生角度上证明该虫尾部的四根棘毛的来源不同，由此建议把左边两根看成是左缘棘毛减少至两根的情形并称之为左缘棘毛，讨论了长期存在混淆的区别，并验证本实验所用材料为前者。