组氨酸修饰的聚乙二醇-聚谷氨酸-聚乙烯亚胺作为基因载体的体外性能研究

为了对组氨酸修饰的阳离子聚合物载体进行研究,重点考察其基因转染效率与细胞毒性,探讨其作为基因载体的可能性。采用自由基聚合法合成聚乙二醇-聚谷氨酸-聚乙烯亚胺-组氨酸(PEG-b-PLG-g-PEIsHISs,GGIS)聚阳离子载体,用1H-NMR表征载体材料结构;通过凝胶电泳实验研究载体对质粒DNA的压缩能力,粒径分析仪测定载体结合DNA后在不同N/P比条件下的粒径及表面电荷;用MTT法测定载体在HEK293T,Hela,BEL7402和A549等细胞株上的细胞毒性,考察GGIS体外细胞转染效率。结果显示在N/P≤30时,载体材料的平均粒径在100~200 nm,表面电荷在10~30 m V,适合细胞吞噬。体外细胞毒性表明,GGIS的细胞毒性较PEI 25K低。GGIS具有较强的DNA缩合能力,且有较好的体外基因转染能力。因此,GGIS有较好的体外基因转染能力,能够携带报告基因在体外有效表达,是具有应用前景的非病毒性基因药物载体。     

PEI季铵盐的阳离子特性研究

分别考察了聚乙烯亚胺(PEI)与季铵化的聚乙烯亚胺(QPEI)对硅藻土进行表面改性,测定它们的Zeta电位;对A3钢板进行了缓蚀实验;用硅藻土进行絮凝实验以及对大肠杆菌进行杀菌性能实验.研究结果表明,与PEI相比,QPEI的阳离子性更强且几乎不受介质pH的影响,经QPEI表面改性的硅藻土微粒的Zeta电位在整个pH范围内一直保持较高的正值,且QPEI对A3钢板的缓蚀效果、对淀粉的絮凝效果以及对大肠杆菌的杀菌效果远高于PEI, 充分显示了季铵化后的聚乙烯亚胺由于带有大量密集的季铵正离子使得它比季铵化前的聚乙烯亚胺具有更强烈的阳离子特性.     

百合花发育相关基因LLGLO1的RNAi载体构建

百合花发育相关基因的研究是开展花卉分子育种的重要基础。以麝香百合(Lilium longi-florumThumb.)未开放的花蕾为材料提取总RNA。根据LLGLO1序列的同源比对选取特异区段,设计引物扩增区段cDNA并引入酶切位点。将PCR扩增片断连接到T载体上,经酶切及PCR验证后进行测序。测序结果表明:用于RNAi的cDNA片断与LLGLO1序列完全相同。通过中间载体pSK+intron引入一段内含子间隔区,RNA干扰片断经过多次的酶切和连接过程最终连入表达载体pCAMBIA1301中形成ihpRNA结构。PCR及双酶切鉴定结果显示,构建的RNA干扰载体的ihpRNA结构完整。     

O型口蹄疫病毒VP1基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

旨在构建能够表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的重组山羊痘病毒(GPV),并以此为活载体疫苗,评估其免疫效力.将FMDV的VP1基因插入转移质粒pTKfpgigp中,构建重组转移质粒pTKfpgigp-VP1,并转染已感染GPV的羔羊睾丸(LT)细胞,产生重组GPV(rGPV),筛选纯化rGPV,检测rGPV在LT细胞中VP1基因的表达情况.将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘(GP)和口蹄疫(FMD)特异性抗体水平.结果表明,获得含有FMDV的VP1基因重组毒株rGPV/FMDVVP1,在LT细胞中VP1基因进行正常转录,其表达产物能与FMDV抗血清产生特异性反应.rGPV能诱导产生不同水平的抗GP和FMD的特异性抗体.可为FMD重组标记疫苗的研制提供参考.     

牛病毒性腹泻病毒GSTZ株E1基因原核表达载体的构建及表达

为研究牛病毒性腹泻病毒的囊膜糖蛋白E1的抗原性,参考了Oregon C24V BVDV毒株的基因组序列(AF091605.1),并设计一对特异引物(上游引物5’-CCC GGA TCC ATG GCC TCT CCC TAC TGT-3’,下游引物5’-GGG CTC GAG TTA CCC TTG TGC TCC TGT T-3’),利用RT-PCR从病毒基因组中扩增E1基因609 bp全长片段,测序结果表明,与C24V株核苷酸同源性达100%.扩增产物经BamHI和XhoI双酶切,亚克隆至原核表达载体,双酶切鉴定表明成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-E1.重组表达载体转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot检测,成功诱导表达出25ku E1蛋白.实验结果为进一步研究BVDVE1蛋白的功能提供了参考.     

一种非病毒载体的组成与体外转基因能力的研究

目的：合成羟丙基β-环糊精偶联小分子量聚乙烯亚胺的共聚物,探讨不同聚乙烯亚胺偶联率的共聚物缩合DNA的能力,探讨不同偶联率的阳离子共聚物组成与转基因效率的关系。方法：通过NMR表征,凝胶阻滞DNA试验考察其缩合DNA能力,以MTT法检测不同偶联率共聚物的细胞毒性。以不同的偶联率共聚物为载体,在不同的N/P比值条件下,将荧光素酶基因导入非洲绿猴肾细胞COS-7,通过荧光素酶的表达检测比较不同偶联率的共聚物转染效率。结果：合成的不同偶联率的共聚物缩合DNA能力不同,转染效率也不同。结论：聚乙烯亚胺偶联率较高的阳离子共聚物缩合DNA的能力较强,转染效率较高。     

PEI介导PKC-α反义核酸对肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用

目的:研究聚乙烯亚胺(PEI)-PKC-α反义脱氧核寡酸(ASODN)对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用.方法:RT-PCR检测肝癌SMMC-7721细胞、HepG2细胞PKC-α mRNA表达的差异,细胞增殖抑制实验检测PEI和ASODN混合的最佳质量比,WST法和克隆形成抑制实验检测细胞增殖抑制作用,免疫荧光检测PKC-α的表达水平.结果:SSMC-7721细胞PKC-α mRNA表达相对较高,PEI和ASODN的质量比为0.75/1时是PEI转染反义核酸的合适比例,对SMMC-7721细胞具有明显的增殖克隆抑制作用,且呈剂量-效应关系;ASODN和PEI-ASODN对SMMC-7721的IC50分别为16.6 μmol/L和0.58 μmol/L;PEI-ASODN能够有效抑制PKC-α蛋白的生物合成.结论:PEI-ASODN能显著抑制SMMC-7721细胞增殖和克隆形成,下调PKC-α蛋白的表达.     

人类8型疱疹病毒K1基因真核表达载体的构建

为构建人类8型疱疹病毒(Human herpesvirus 8,HHV-8)K1基因的真核表达载体,采集卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)患者血清,采用柱式病毒DNA抽提试剂盒抽提血清中的病毒DNA,采用套式PCR技术检测HHV-8的特异性片断KS330233以判断是否得到了HHV-8 DNA,采用PCR技术扩增HHV8 K1基因并纯化回收,酶切、连接入真核表达载体pcDNA3.1,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆pcDNA3.1/HHV8-K1扩增后,提取质粒,进行双酶切和DNA测序鉴定.结果显示采集了经典型KS血清3例,提取了血清HHV-8DNA,扩增了特异性片断KS330233,测序结果正确提示我们得到了HHV8 DNA,扩增了HHV8 K1基因,构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性.由此可知:成功构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定良好的实验基础.     

AuNPs/PEI/GO纳米复合物修饰电极的制备及电化学应用

利用高分子聚合物壳聚糖链上富含的氨基修饰石墨烯,制备了具有独特性质的石墨烯基纳米复合材料,并利用壳聚糖对金纳米粒子良好的保护作用,使金纳米粒子固载到石墨烯纳米复合材料的表面,合成了一种具有生物相容性的金纳米粒子/氧化石墨烯纳米复合材料.同时,利用UV-vis、FT-IR、Zeta电位仪、XRD粉末衍射仪、TEM等对所制备石墨烯基纳米复合材料进行了表征.结果表明,PEI/GO/GC,AuNPs/PEI/GO/GC修饰电极对H2O2具有更好的电化学催化性能.     

依折麦布对高迁移率族蛋白1诱导血管内皮细胞激活的影响机制研究

目的探讨依折麦布对高迁移率族蛋白1(HMGB1)诱导血管内皮细胞激活影响的分子机制.方法分离、培养雄性SD大鼠胸主动脉内皮细胞,分为空白对照组、HMGB1刺激组、依折麦布组(HMGB1刺激前10μmol/L依折麦布预处理)、CLI-095组(HMGB1刺激前1μmol/L CLI-095预处理).荧光定量分析中性粒细胞与内皮细胞的黏附能力;RT-PCR和Western blot检测内皮细胞中TLR4,ICAM-1、可溶性E选择素mRNA和蛋白表达水平;EMSA法检测NF-κb-p65的DNA结合活性.结果 HMGB1活化的内皮细胞与中性粒细胞黏附活力均明显高于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05);依折麦布组、CLI-095组内皮细胞与中性粒细胞黏附活力均明显低于HMGB1诱导组,差异具有统计学意义(P0.05).HMGB1刺激组的内皮细胞TLR4,mRNA和蛋白表达量明显高于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05);依折麦布组和CLI-095组mRNA和蛋白表达量均明显低于HMGB1组,差异具有统计学意义(P0.05).HMGB1组内皮细胞NF-κb p65亚单位核位移明显强于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05);依折麦布组和CLI-095组较HMGB1组核位移明显减弱,差异具有统计学意义(P0.05).HMGB1组ICAM-1、可溶性E选择素表达水平明显高于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05).而经依折麦布、CLI-095干预后可明显降低ICAM-1、可溶性E选择素表达水平,与HMGB1组之间差异具有统计学意义(P0.05).结论依折麦布可通过调节黏附分子(ICAM-1、可溶性E选择素)的表达而有效抑制HMGB1诱导的血管内皮细胞活化效应,其机制与抑制TLR4的表达和NF-κb激活有关.     

线性与分枝状聚乙烯亚胺介导基因体外转染的比较与研究

聚乙烯亚胺(PEI)是一类新兴的阳离子多聚物非病毒载体,可缩聚DNA分子形成颗粒并转入真核细胞进行表达.本文选用分子量750 ku分枝状PEI与分子量25 ku线性PEI转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因于HeLa细胞,并对这两种PEI的转染效率进行比较.利用MTT法检测比较线性PEI与分枝状PEI的细胞毒性.通过凝胶阻滞实验比较两种PEI结合DNA能力.最后利用肝素介导释放实验比较两者在形成PEI/DNA复合物后释放DNA的能力.研究结果表明:线性PEI转染效率优于分枝状PEI,且随PEI/DNA质量比的增加而升高,而分枝状PEI则相反;两种PEI细胞毒性在一定范围内相近;分枝状PEI结合DNA能力略强于线性PEI;但是分枝状PEI释放DNA的能力远小于线性PEI.这可能导致DNA在细胞内无法从PEI/DNA复合体上释放出来,从而影响转录的正常进行,最终导致分枝状PEI转染效率下降.     

Predictive Value of High Mobility Group Box-1 and miR-146b in Septic Shock Patients

In the face of the elevated incidence and mortality rate of septic shock in the ICU, this retrospective study seeks to investigate the indicative and predictive value of high-mobility group box 1(HMGB1) and miR-146b in patients with septic shock. Quantitative RTPCR was employed in this study to quantify the HMGB1 and miR-146b levels in plasma samples obtained from the patient group and healthy controls. The investigation involved the comparison between the two groups and tracking changes in the ...     

人类IRX1基因在肾脏维持高水平表达

从人类胚胎脑组织中提取总RNA,分离纯化mRNA,构建cDNA文库,以此文库为模板,用5'-RACE法获得人类IRX1 (HIRX1)的全长,其长度为2 054 bp.Northern blotting检测了HIRX1在胚胎时期和成体的表达情况,结果显示,HIRX1与小鼠6个IRX在胚胎心脏表达的情况大不相同,其在肾脏组织强烈表达,脑组织和肺其次,从胚胎各个时期到成体在肾脏组织都维持高水平表达,在肺组织维持较低水平表达,在脑组织只限制在胚胎时期表达,在心脏组织不管是胚胎还是成体时期都没有可检测水平,表明HIRX1可能参与脑、肺,特别是肾脏的发育,或者对此类器官功能的发挥起重要作用,与心脏的发育很可能没有相关性.     

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

磷酸化壳聚糖-季铵化壳聚糖载体提高体内外基因转染功效

本研究通过磷酸化壳聚糖(PC)包被季铵化壳聚糖(TMC)/质粒(pDNA)纳米复合物,制备PC/TMC/pDNA三元复合物(PTC),用于提高体内外基因转染功效.PTC粒径为100~200nm,Zeta电势为-16~-34mV,可有效缩合pDNA,保护pDNA免遭核酶降解.PC降低PTC中pDNA结合力,增加体外释放量.表面荷负电的PTC抗非特异性蛋白吸附能力强,经小窝蛋白介导的细胞内吞途径入胞后逃避溶酶体降解,细胞核内分布比例高.HEK293细胞体外转染试验结果显示,PTC体外转染效率是TMC/pDNA纳米复合物(TC)的1.5~3.1倍;小鼠胫前肌注射给药试验结果表明,PTC可显著提高基因体内转染效率.因此,合适质量比的PTC有望作为功能性基因药物的递送载体,用于基因治疗.     

黄曲霉毒素高污染区肝细胞癌P53基因高频率定点突变

用聚合酶链反应及限制性片段长度多态性（ＰＣＲ＿ＲＦＬＰ）分析技术，对广西黄曲霉毒素高污染２例肝细胞癌（ＨＣＣ）进行分析，检查Ｐ５３基因第７外显子的２４９密码子的突变频率。结果发现３６／５２例ＨＣＣ中２４８密码子有集中的点突变，频率为６９．２％。Ｐ５３基因突变热点与乙型肝炎病毒感染无关。提示黄曲霉毒素Ｂ１是突变热点的主要原因。     

人纤溶酶原K1—3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原Krigle 1-3(K1-3)基因插入融合表达载体pET-17b,获得重组质粒pET-K13,转化E.coli BI21(DE3),在IPTG诱导下,人纤溶酶原K1－3基因在E.coli BI21(DE3,pET-K13)中获得高效融合表达,表达量占菌体总蛋白的24％,表达产物以包函体存在,Western blot证明重组 蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性。     

S-1联合奥沙利铂方案一线治疗晚期胃癌 有效性及安全性分析

目的探讨S-1联合奥沙利铂方案一线治疗晚期胃癌的有效性及安全性.方法选取60例晚期胃癌患者作为研究对象,随机将其分为研究组和对照组,研究组采用S-1+L-OHP方案进行治疗,对照组采用FOL-FOX方案进行治疗.结果研究组和对照组患者有效率比较差异无统计学意义(P0.05);研究组疾病控制率为80.0%,优于对照组的53.3%,且差异具有统计学意义(P0.05);研究组和对照组中位TTP比较差异具有统计学意义(P0.05);两组中位OS比较差异无统计学意义(P0.05);研究组外周神经毒性发生率明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05),其余不良反应发生率比较差异均无统计学意义(P0.05).结论 S-1联合奥沙利铂治疗晚期胃癌具有良好的疗效及安全性,与FOL-FOX方案比较,不良反应低,且静脉滴注时间短,患者依从性好.