细茎大豆（G.gracilis）rbcS基因结构与分子进化分析

从细茎大豆的嫩叶中提取总ＤＮＡ，用ＰＣＲ方法扩增得到包含完整编码区的ｒｂｃＳ基因并将其克隆到ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ载体中。完成全基因１０８９个核苷酸测序后，运用ＰＣＧＥＮＥ进行顺序编辑和同源比较，并应用ＭＥＧＡ１．０２１软件中的Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ方面画出Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基仓的系统进化树。     

热休克转录因子（σ^32）基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌热休克蛋白转录因子σ＾３２的编码基因ｒｐｏＨ，并将基克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ＰＵＨＥ中。     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

豌豆中GPAT基因编码cDNA的克隆及分析

参照国外报道的豌豆ＧＰＡＴ基因ｃＤＮＡ序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，通过ＲＴＰＣＲ技术，从云南地方栽种的豌豆品种中分离到了ＧＰＡＴ基因的编码ｃＤＮＡ片段，并将其纯化后直接克隆到ｐＧＥＭＴ载体系统中，经ＮｃｏⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切鉴定，所得的重组质粒中含有１３８０ｂｐ左右的片段．采用ＰｓｔⅠ，ＨｉｎｄⅢ两种限制性内切酶进行酶切，酶切图谱分析表明所克隆的豌豆ＧＰＡＴ基因编码ｃＤＮＡ的酶切图谱与国外所报道的该基因ｃＤＮＡ的酶切图谱一致，暗示了该基因在进行上具有一定的保守性．     

人抑癌基因nm23—H1在逆转录病毒载体上表达的研究

应用基因工程的方法，将抑癌基因ｎｍ２３－Ｈ１的ＤＮＡ片段克隆到逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ，得到重组质粒ｐＬＸＳＮ－ｎｍｈ１。用磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染到辅助包装细胞ψＣＲＩＰ中，通过Ｇ４１８筛选，得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测证实：ｎｍ２３－Ｈ１基因已整合到克隆细胞的染色体上，并且得到表达。获得的逆转录病毒滴度达１０５ＣＦＵ／ｍＬ。     

猪瘟病毒HCLV株E2核苷酸序列与结构分析

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＣＳＦＶ ＨＣＬＶ株Ｆ４８２代感染兔脾的细胞总ＲＮＡ中分段扩增出ＣＳＦＶ Ｅ２基因特异的３个部分重叠的ＤＮＡ片段,并将之分别克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,经核苷酸序列测定和片段重叠完成了包含Ｅ２全长基因的１１４４ｂｐ序列的测定,其ＧＣ含量为４９．０％,核苷酸序列与国外报道的各株病毒的Ｅ２基因同源性分别不８３．５％＿９７．５％．     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

抑癌基因FHIT的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法，从人脑ｃＤＮＡ库中克隆ＦＨＩＴ基因，扩增得到５５３ｂｐ片段克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ载体，测定了其ＤＮＡ序列。该序列包括ＦＨＩＴ ｃＤＮＡ编码区全部４４４ｂｐ，以及５‘端５２ｂｐ和３’端５７ｂｐ非编码区序列。编程区有二处位点发生突变，第９２位密码子中的Ｃ突变成Ｇ，是同义突变，不导致氨基酸改变；     

用加端PCR技术改造h－IGF－1cDNA

用ＤＮＡ合成仪合成了分别带有ＰｓｔＩ位点和ＳａｌＩ位点及终止密码子的２个用于扩增ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ的ＰＣＲ引物．利用合成的引物，７００ｂｐ长的ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ模板和Ｔａｑ聚合酶进行ＰＣＲ扩增．扩增产物经电泳鉴定后克隆进Ｍ１３ｍｐ１８载体，进行核苷酸序列分析．结果显示：ＰＣＲ产物含已发表的ｈＩＧＦ－１成熟蛋白的编码序列和５＇端的ＰＳｔＩ位点及３＇端的ＳａｉＩ位点及终止密码ＴＡＧ．用加端ＰＣＲ技术成功地扩增和改造了ｈＩＧＦ－１的编码序列．     

GHRP—scu—PA—32K突变体的构建,表达及纯化产物的部分性 …

在ｓｃｕ－ＰＡ３２Ｋ的ｃＤＮＡ分子基础上经定点突变,在Ｎ端紧接Ｌｅｕ＾１以前引入编码ＧＨＲＰ四肽的寡核苷酸序列（ＧＧＴＣＡＴＡＧＧＣＣＴ）,构建了ＧＨＲＰ－ｓｃｕ－ＰＡ－３２Ｋ的突变体ｃＤＮＡ。将它克隆到表达载体ｐＣＭ－β－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ＾－细胞。筛选到的稳定表达株在无 清培养基的表达量为５８０ＩＲ／（１０＾６细胞．２４ｈ）。经锌离子螯合亲和柱纯化的产物,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示为一蛋     

脂肪酶基因结构和氨基酸序列的比较

采用PCGENE6 8软件系统对真菌脂肪酶基因和氨基酸序列进行了分析。真核生物中多数结构基因中含有内含子 ,但真菌脂肪酶基因几乎有一大半的是连续的 ;对于有内含子的基因 ,不同脂肪酶基因所含内含子数目各异。所有脂肪酶一级结构中都包含Gly X1 Ser X2 Gly保守序列 ,在真菌脂肪酶中该序列更保守 ;Ser、Asp/Glu和His3个氨基酸残基组成了真菌脂肪酶的活性中心 ;大多数真菌脂肪酶是糖蛋白 ,但也有一些不含糖基的脂肪酶 ,主要取决于脂肪酶一级结构中是否存在糖基化识别序列。     

大脑中动脉阻塞模型大鼠不同脑区脑c-fos和HSP70基因的调节

采用 DNA-RNA分子杂交技术研究了大脑中动脉阻塞模型大鼠不同脑区即刻早期反应基因 c-fos和热休克蛋白基因 HSP70的表达。实验结果表明 ,局灶性脑缺血可诱导 c-fos和 HSP70的表达 ;因不同脑区对缺血的敏感度不同 ,c-fos和 HSP70的表达程度及表达时间亦不尽相同 ,c-fos主要在海马和皮层中表达 ,而 HSP70则主要出现在皮层和文体区。结果提示 :c-fos的表达与各脑区的损伤程度有关 ,是脑损伤的早期反应指标之一 ;HSP70则是一种与缺血耐受性有关的保护性蛋白。     

水稻S5-ORF3蛋白质的进化分析

生殖隔离在形成新物种和物种同一性的保持中有重要作用,因而在水稻优化育种中有重要的意义。S5位点是一个已克隆的控制水稻生殖隔离的基因,它产生的S5-ORF3,ORF4和ORF5蛋白质共同调控着indica-japonica杂交后代的育性,特别是S5-ORF3蛋白质在打破水稻亚种indica-japonica之间的生殖隔离与促进物种间的基因交流中发挥重要作用。针对S5-ORF3的进化分析对于研究它的功能和起源很重要,但目前尚无报道。本文基于序列和进化分析,提出S5-ORF3为一种定位在内质网中的新的HSP70家族蛋白,但缺乏HSP70的C端的多肽结合结构域,推测S5-ORF3可能通过影响alpha-淀粉酶的合成来作用于内质网压力;找到了ORF3的19条同源蛋白,并用极大似然算法构建了可靠的进化树,发现水稻的S5-ORF3与节节麦的luminal-binding蛋白进化关系最为密切;作了置信度100%的S5-ORF3蛋白质的三维结构预测,预测了居中的配体绑定位点;发现了水稻的S5-ORF3与其他HSP70蛋白相比独特的基序,为进一步研究S5-ORF3的作用机理和演化历史提供了线索和数据支持。     

水稻矮化突变体G蛋白α亚基基因的结构和表达

利用γ-Co60辐射诱发水稻特光矮-2(Oryza sativa L.cv.TGA-2)产生变异,获得一种稳定遗传的新型水稻矮化突变体dwarf69.dwarf69和TGA-2及其杂交后代F1、F2、F3成熟期的株高数据表明矮化表型受一对隐性基因控制.进一步研究发现,虽然dwarf69和TGA-2的G蛋白α亚基基因(Rice G protein alpha-subunit,RGA)编码区核苷酸序列只有一个核苷酸的差异,但RGA在野生型TGA-2中的表达量明显高于在突变体dwarf69中的表达量.对矮化突变体dwarf69和野生型TGA-2的RGA基因5＇上游区的序列分析表明,dwarf69 RGA 5＇上游区比TGA-2RGA5＇上游区多出1076bp.首次报道水稻矮化突变体中的RGA5＇上游区序列与其野生种的RGA5＇上游区序列存在显著的差异.     

腹泻性贝毒在翡翠贻贝中的积累、排出及其对HSP70表达的影响

以利玛原甲藻(Prorocentrum lima)为饵料,通过室内滤食实验,考查了腹泻性贝毒(diarrheic shellfishpoisoning,DSP)在翡翠贻贝(Perna viridis)体内的累积与排出规律,分析了HSP70基因的表达与毒素累积与排出之间的关系.结果显示,翡翠贻贝暴露于产毒利玛原甲藻后,其滤食率显著下降,存在明显的剂量-效应关系.毒素积累阶段,翡翠贻贝鳃组织中DSP毒素显著增加,均明显高于对照组(P<0.05).停止染毒后,贻贝体内毒素含量显著下降.染毒后,随着毒素的累积,HSP70显著增加,并于第2天达到高峰.这些结果提示,翡翠贻贝对DSP毒素有一定的清除及耐受能力,HSP70基因的诱导表达可能是贻贝对DSP毒素胁迫的一种适应性反应,可能在贻贝抗DSP毒素中发挥重要作用.     

用RT-PCR技术研究水稻中抗病基因同源序列DFR-1、OsMlo-1所在基因的功能

DFR-1、OsMlo-1分别是最近从水稻中克隆的玉米Hml和大麦中Mlo抗病基因同源序列，这两个序列与两个已报道的水稻抗稻瘟病数量性状位点（QTLs）有较好的对应关系，表明它们所在的基因可能参与抗病反应，为了进一步研究水稻DFR-1、OsMlo-1所在基因的功能，在DFR-1、OsMlo-1假定的外显子上设计引物，通过RT-PCR技术，研究在接种白叶枯病（Xanthomanas oryza pv oryzae）菌株PX099以及接种稻瘟病（Magnoparthe grisea）菌株V86013前后，水稻品种IRBB13和水稻品种明恢63中DFR-1、OsMlo-1所在基因的表达．结果表明：在接种白叶枯病菌株PX099的水稻品种IRBBl3中与DFR-1对应的基因是诱导增强的；在接种稻瘟病菌株V86013的水稻品种明恢63中与DFR-1、OsMlo-1对应的基因是诱导增强的，进一步表明DFR-1、OsMlo-1所在的基因可能参与水稻抗病反应。     

Characterization of enhancer trap and gene trap harboring Ac／Ds transposon in transgenic rice

Insertion mutagenesis has become one of the most popular methods for gene functions analysis.Here we report a two-element Ac/Ds transposon system containing enhancer trap and gene trap for gene tagging in rice.The excision of Ds element was examined by PCR amplification.The excision frequency of Ds element varied from 0% to 40% among 20 F2 populations derived from 11 different Ds parents.Southern blot analysis revealed that more than 70% of excised Ds elements reinserted into rice genome and above 70% of the reinserted Ds elements were located at different positions of the chromosome in rice.The result of histochemical GUS analysis indicated that 28% of enhancer trap and 22% of gene trap tagging plants displayed GUS activity in leaves, roots,flowers or seeds.The GUS positive lines will be useful for identifying gene function in rice.