黑线仓鼠催乳素受体（PRLR）基因部分序列的克隆与序列分析

采用基因克隆方法首次扩增出黑线仓鼠催乳素受体（Prolactin Receptor,PRLR）基因5’端部分序列（GenBank登录号为EU826030）,测序结果表明该片段的有效长度为379bp,包含部分5’调控区、exonl及部分intron1．该序列与其它物种相应区域的同源性比较结果：黑线仓鼠与人、大鼠、小鼠、狐猿、黑猩猩、类人猿PRLR基因核苷酸序列的同源性为82．1％-93．4％;exon1序列的同源性为79．8％-91．4％．系统进化分析与物种亲缘关系的远近一致,同时证明PRLR基因exon1有较大的可变性,因此认为成功克隆了黑线仓鼠的PRLR基因的部分序列．该研究所得到的PRLR基因序列可用作研究物种亲缘关系或遗传距离的理想标记．     

黑线仓鼠MHCⅡ类DQA基因外显子2的克隆与序列分析

为了探明黑线仓鼠MHC的结构与功能并寻找分子标记,对MHCⅡ类DQA基因的外显子2进行克隆和序列分析．提取黑线仓鼠3个群体（吴村、沂南和临朐）的基因组DNA构建基因池,利用PCR技术扩增得到249bp的片段,将该目的片段连接到pMD18-T载体中,重组质粒转入大肠杆菌DH5α后利用蓝白斑法筛选阳性克隆,测序后得到该目的片段的核苷酸序列（Genbank登录号：FJ209306）并推导出氨基酸序列．结果表明：黑线仓鼠、人类、大鼠、小鼠、猪、马、牛、兔之间DQA基因外显子2的核苷酸序列同源性为68．7％-85％,氨基酸序列同源性为56．8％-83．5％,黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系更近．测序得到的OQA基因外显子2的序列在物种间具有丰富的多态性,可以作为物种遗传分析的分子标记．     

黑线仓鼠Htr1a克隆及生物信息学分析

Htr1a是介导5-HT系统功能的关键,主要分布于额叶皮层、海马、外侧隔、中缝背核、脊髓前角等.该研究以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为实验材料,用RT-PCR技术克隆黑线仓鼠Htr1a的部分cDNA序列1486bp(GeneBank登录号:MH169583),运用生物信息学对Htr1a核酸序列以及蛋白质序列进行分析,构建系统进化树.研究结果表明:克隆的Htr1a部分cDNA序列包含一个完整的开放阅读框1269bp,部分5′,非翻译区和部分3′,非翻译区,共编码422个氨基酸.Htr1a蛋白质分子量为46332.47Da,等电点为9.18,该蛋白质有7个跨膜螺旋,一个G蛋白偶联受体家族标签,不含有信号肽,不属于分泌蛋白,疏水性分析也表明其符合膜蛋白的特征;同源性比对和系统进化树分析显示,黑线仓鼠与中国仓鼠(Cricetulus griseus)亲缘关系相近,与啮齿类较近,而与其他哺乳类和鸟类物种的亲缘关系均较远,这与传统的物种分类相一致.以上结果证实本实验成功克隆到黑线仓鼠Htr1a的部分cDNA序列,为进一步探究黑线仓鼠5-HT系统功能奠定了分子生物学基础.     

黑线仓鼠GAL克隆及生物信息学分析

以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为对象,采用RT-PCR技术克隆黑线仓鼠GAL cDNA序列482 bp,采用生物信息分析软件对GAL进行基因序列分析表明,结果显示GAL包括完整CDS区375 bp和部分5′和3′非编码区,共编码124个氨基酸,GAL蛋白质分子量为13199.05 Da,其不稳定指数为44.67,高于40,表明GAL蛋白不稳定.GAL含有信号肽,为分泌蛋白.同源性比对及系统进化树分析,数据显示黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)与中国仓鼠(Cricetulus griseus)亲缘关系相对较近,而与啮齿类等亲缘关系次之,与灵长类及其他鸟类物种亲缘关系较远,这与传统的物种分类较为一致,进而验证克隆所得到的GAL cDNA序列准确,体现了GAL进化的保守性,为探究GAL在动物繁殖调控中的作用提供了一定的理论基础.     

野牦牛与其他牛科动物GHRHR基因部分序列的比较

对野牦牛生长激素释放激素受体（GHRHR）基因部分片段（包括部分外显子6和部分内含子6）进行PCR扩增、克隆和序列测定,序列已提交到GenBank中（GenBank Accession No：EU872256）。利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9等生物信息学软件对野牦牛该基因序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛、绵羊等牛科动物相应序列进行比对分析。结果表明：野牦牛与普通牛、瘤牛、水牛、绵羊4个物种基因序列间同源性大小依次为99.0%、98.3%、97.8%、92.0%,5个物种间共发现42处序列间碱基差异（9.84/100 bp）,其中野牦牛与普通牛、瘤牛、水牛、绵羊4个牛科物种均存在差异碱基3处;推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为94.4%、94.4%、100.0%、94.4%。     

黑线姬鼠OPN部分编码区结构与分子系统进化分析

以近缘种OPN的cDNA序列为参考设计引物,通过RT-PCR得到黑线姬鼠OPN部分序列,并将得到的cDNA序列翻译成氨基酸序列,注册到GenBank(登陆号:HM626723).利用该序列构建系统进化树,同时对其编码的蛋白质进行一级结构分析及二级结构预测.结果表明:克隆得到的209 bp OPN的序列,包括部分外显子4...     

黑线仓鼠OPN5的部分克隆及生物信息学分析

神经视蛋白(Neuropsin,OPN5)是非视觉成像蛋白的重要成员之一,主要分布于动物的眼睛、脊髓、大脑和睾丸中,是动物感光物质的重要组成成分.文章以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为动物材料,利用RT-PCR技术克隆得到黑线仓鼠OPN5基因的cDNA序列1340bp(KY949483).生物信息学分析表明,该序列包括一个完整的开放阅读框架1134bp,部分5'端非翻译区和部分3'端非翻译区;序列G+C含量远高于A+T含量,提示其Tm值较高,热稳定性强;编码377个氨基酸;蛋白质序列组成、跨膜区和疏水性分析、信号肽分析等均表明,OPN5序列包含N端胞外区、跨膜域和C端胞内域,整体疏水性较强,没有信号肽,不属于分泌蛋白,这些特征均与OPN5膜蛋白的属性相符;OPN5包括7个跨膜拓扑结构、一个G蛋白偶联受体家族和一个视黄醛结合位点,第7个跨膜结构的赖氨酸残基与OPN5对紫外光的敏感性有关;同源性对比显示,黑线仓鼠与中国仓鼠(Cricetulus griseus)、金仓鼠(Mesocricetusauratus)、小鼠(Mus musculus)亲缘关系较近,而与灵长类、偶蹄类的物种亲缘关系均较远,这与传统的物种分类相一致,证实所克隆到的序列正确,同时提示OPN5进化的保守性.本研究为探究OPN5视蛋白在动物繁殖调控中的作用奠定了基础,具有重要理论的意义.     

黑线仓鼠Cry1、Cry2克隆及生物信息学分析

隐花色素(Cryptochromes,包括Cry1和Cry2)编码黄素腺嘌呤二核苷酸结合蛋白,是昼夜节律核心振荡器复合物的关键组分,是各种生理功能的重要调节因子.本实验以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为材料,通过设计特异性引物,RT-PCR技术克隆得到黑线仓鼠Cry1 cDNA序列1822 bp(GeneBank登录号:MK796241)、Cry2 cDNA序列1945 bp(GeneBank登录号:MK796242).运用生物信息学对Cry1、Cry2核酸序列以及蛋白质序列进行分析,构建系统进化树,结果表明:测得的Cry1 cDNA包括一个完整的开放阅读框1764 bp,部分5′端非翻译区和部分3′非翻译区,编码587个氨基酸,A+T含量略高于G+C含量;测得的Cry2的cDNA包括一个完整的开放阅读框1794 bp,部分5′端非翻译区和部分3′非翻译区,编码597个氨基酸,G+C含量远高于A+T含量,提示其Tm值较高,热稳定性强. CRY1、CRY2理论蛋白分子量为66469.86 Da、67427.08 Da,等电点(pI)为8.40、8.82,均为不稳定蛋白. CRY1、CRY2蛋白跨膜区和疏水性分析和信号肽分析等均表明,整体疏水性不强,为亲水性蛋白;没有信号肽,不属于分泌蛋白,与其作为转录抑制因子相符合.功能结构域预测表明,二者均含有两个高度保守的功能结构域:DNA光解酶及FAD结合域.同源性比对及系统进化树分析显示,黑线仓鼠与中国仓鼠亲缘关系最近,与灵长类目及鸡形目亲缘关系较远,这与传统的分类物种分类方式相一致,证实本实验测得的Cry1、Cry2基因序列正确,体现了Cry1、Cry2进化的保守性.本实验为探究昼夜节律基因Cry1、Cry2在动物繁殖调控中的作用奠定了基础,具有重要的理论意义.     

扇形游仆虫谷胱甘肽过氧化物酶cDNA的克隆及序列特征分析

采用cDNA 末端快速扩增( rapid amplification of cDNA ends,RACE) 技术,对纤毛虫原生动物扇形游仆虫（Euplotes vannus）GPx cDNA特征进行分析. 克隆到扇形游仆虫GPx cDNA全长序列为672bp,该序列编码182个氨基酸,属硫氧还蛋白超家族,且具有一定的保守性,含有3个催化残基和3个特征性基序．氨基酸序列进化分析结果表明,扇形游仆虫与其他纤毛虫物种同源性较高,亲缘关系较近,研究结果为扇形游仆虫GPx在生态毒理学的应用提供基础信息．     

黑线仓鼠KiSS-1基因的生物信息学与系统进化研究

采用RT-PCR技术克隆得到黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)KiSS-1基因的部分序列,并进行生物信息学分析。结果表明:该段序列共429bp,包含部分5’非翻译区、转录起始位点、信号肽序列以及主要的活性区域。黑线仓鼠KiSS-1编码的蛋白质是一种胞外分泌的亲水性蛋白质,N端含有19个氨基酸组成的信号肽序列,67、121-122位各有一个水解位点,68、69处的磷酸化位点可能与蛋白质活性的获得有关。二级结构预测含有较多的α螺旋和自由卷曲,115-119位的α螺旋在与受体结合中有重要作用。系统进化分析证实该序列与其他物种有较高的同源性,说明该基因在进化中相对保守。通过生物信息学与系统进化分析,有助于进一步揭示KiSS-1的转运加工途径及作用机制。     

广西巴马小型猪肌肉生长抑制素(Myostatin)cDNA克隆和序列分析

目的通过RT-PCR扩增广西巴马小型猪Myostatin cDNA序列,经过连接、转化、克隆测序后,与NCBI中发表的猪Myostatin序列进行同源性比较,分析广西巴马小型猪Myostatin的cDNA序列结构特点及与其他物种间的聚类关系,为日后构建Myostatin高效表达载体及进一步研究Myostatin对广西巴马小型猪肌肉生长的影响奠定基础。方法以广西巴马小型猪的肌肉组织总RNA为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),利用合成的特异性引物,扩增得到巴马小型猪肌肉生长抑制素(Myostatin)cDNA的全序列。该扩增片段经纯化后,连接到pMD18-T载体上扩增,经一系列鉴定后,测序。结果本实验克隆到巴马小型猪Myostatin基因cDNA序列长度为1128 bp,与GenBank报道的猪Myostatin基因cDNA序列同源性高达99.7%,与人、奶牛、家鼠等物种的cDNA序列间同源性可达到92.3%以上,证明Myostatin基因具有较高的保守性。同时发现广西巴马小型Myostatin基因cDNA序列有三处存在碱基突变,两个为同义突变,一个为错义突变。     

Cloning of human cytokine signal transduction inhibitor genehumSOCS-2

An EST (gb/AA115239) with high identity to the mouse cytokine signal transduction inhibitor genemmSOCS-2 was selected in GenBank EST database by the homologous screening method. The cDNA with the same sequence of the EST was got in human placenta cDNA library by PCR and a 1011 bp cDNA fragment was selected using above cDNA as probes to perform walking hybridization in placenta cDNA library. The cDNA fragment contains one 594 bp open reading frame (ORF) which encodes 198 amino acid residues. It was proved to be novel after NCBl database screening. Homology comparison showed that this gene has 93% identity tommSOCS-2 at the amino acid level and it has high identities to other related genes in SH₂ domain and SOCS box, so it was namedhumSOCS-2 and the accession number in GenBank is gb/AF020590. The expression analysis showed that the gene is expressed obviously higher in prostate than in other 15 human tissues.     

金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的克隆及其序列特征分析

根据酸性海藻糖酶的蛋白质序列设计引物,PCR扩增出CQMa102 ATM1的cDNA和DNA序列,登录号分别为:DQ237957,EF190950.序列分析表明,ATM1 DNA序列含有3个内含子,其开放阅读框(ORF)编码1个含1 073个氨基酸的蛋白质,具有1个20个氨基酸的信号肽序列和含有30个可能的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr).NCBI序列比对(Blastn)显示该蛋白与Aspergillus fumigatus的alpha、alpha-trehalose glucohydrolase,Aspergillus nidulans的酸性海藻糖酶前体和Talaromyces emrsonii的酸性海藻糖酶分别有62%、59%和57%的氨基酸相似性,与另外两个真菌Saccharomyces cerevisiae(Ath1p)和Candida albi-cans(Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有约25%的氨基酸相似性.Southern杂交表明,ATM1基因在CQMa102基因组中为单拷贝.     

人Rab蛋白cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库中克隆到一种新的Rab cDNA,全长920bp,以编码213个氨基酸残基,该蛋白预测的分子质量为24567u,等电点7．34,经同源比较,该cDNA与GenBank数据库中登录号为X14964的Rab蛋白有83％的相似性和76％的相同性,将该cDNA克隆到经改造的PBV220表达质粒,转化DH5a菌株诱导表达出该蛋白,取24种不同组织的总cDNA各100ng,用该基因序列设计引物作PCR,结果在胎肝组织中检测到有明显条带,表明该Rab基因相对在胎肝有高表达。     

斑马鱼cGnRH-Ⅱ的基因克隆与序列分析

从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT--PCR方法克隆eGnRH cDNA,其长度为646bp,包括一个258bp开放阅读框;编码的cGnRH-Ⅱ前体为86个氨基酸残基,由一个信号肽、GnRH十肽和一个由蛋白水解位点（Gly—Lys—Arg）连接的促性腺激素释放激素相关肽（GAP）组成;其中信号肽和联接肽的长度分别为24和49个氨基酸．该eDNA编码的cGnRH-Ⅱ的前体氨基酸序列与其他物种的cGnRH-Ⅱ前体一致．表明物种问cGnRH—Ⅱ cDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低．进化分析表明,斑马鱼与鲤鱼、鲫鱼、拟鲤、黑头软口鲦等淡水的鲤科鱼类的同源性较高．     

库拉索芦荟6号染色体表达序列标签的研究

将微分离的库拉索芦荟(Alove vera[L.] Burm.f)6号染色体DNA及库拉索芦荟叶总cDNA分别用LA-PCR(linker adaptor polymerase chain reaction)方法扩增,然后采用杂交片段扩增技术(hybrid specific amplification,HSA)分离6号染色体与cDNA同源的表达序列片段.对表达序列片段进行克隆,得到约40000个重组子.随机选取96个克隆进行分析,分别用DIG标记6号染色体的LA-PCR产物和cDNA扩增产物作探针对其进行点杂交,对显示阳性信号的克隆进行测序.将库拉索芦荟6号染色体的表达序列标签(expressed sequence tags, EST)与GenBank中核苷酸进行比较,发现库拉索芦荟6号染色体的表达序列中有87.4%与植物的EST具有同源性,12.6%的EST与人或动物的EST具有较弱同源性,其中与石刁柏的EST及非生物素胁迫下的小麦(Triticum aestivum)、咖啡(coffee)、高梁(Sorghum bicolor)和菠萝(pineapple)等作物的EST具有很高的同源性(＞93%).     

极大节旋藻气囊蛋白基因gvpA克隆与序列分析

为了研究极大节旋藻气囊蛋白的分子生物学特性,并为gvpA基因的研究提供基础材料,在对极大节旋藻GSS序列分析的基础上,采用PCR技术克隆了gvpA基因的全长序列,并进行了相关分析。结果表明极大节旋藻gvpA基因编码区的GC含量为42.92%,核苷酸序列和蛋白序列与Planktothrix agardhii的gvpA基因相似性最高(79.4%,97.2%),其次是Pseudanabaena sp.PCC6901(75.3%,94.4%)。系统发生分析表明极大节旋藻gvpA基因与Planktothrix agardhii的gvpA基因同源性最高(89%ML,85%MP,89%NJ)。     

水稻几丁质酶基因(Oschi)cDNA的克隆及序列分析

 以成功克隆大蕉几丁质酶基因（MpChi-1）时设计的一对引物,采用RT-PCR技术从广亲和水稻品种（Oryza．satival L．Cpslo17）中扩增到一水稻几丁质酶的全长cDNA,长1 115 bp,命名为Oschi;此序列已在GenBank中注册,登录号为EU045451;将Oschi基因核苷酸测序结果在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索;并将Oschi的cDNA序列及氨基酸序列与大蕉及其它单子叶植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树;结果显示此基因具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构;与大蕉核苷酸序列相比同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,与预测登记的最相近的水稻［Oryza sativa(japonica cultivar-group)］核苷酸序列相比同源性为98%, 氨基酸序列同源性为98%;广亲和水稻Oschi基因与大蕉MpChi-1基因的序列及蛋白结构有较高的一致性。     

棉铃虫泛素基因的克隆及序列分析

泛素介导的泛素-蛋白酶体通路(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是真核细胞内依赖ATP的非溶酶体蛋白质降解途径,该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用.设计一对简并引物,从棉铃虫Helicoverpa armigera卵巢细胞Ha831中克隆了泛素基因的编码区,GenBank登录号AY456195.序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码76个氨基酸、其编码蛋白的相对分子质量为8 560,等电点为6.56.同源性比较发现,棉铃虫泛素基因与其他真核生物泛素基因在氨基酸水平上具有96%以上的相似性,而与棉铃虫核多角体病毒泛素的相似性为76%,所有已知的泛素关键功能位点在该泛素蛋白中均保守存在.     

平颏海蛇CRVP基因全长cDNA片段的克隆和序列分析

通过对平颏海蛇毒腺cDNA文库的随机测序和PCR筛选,克隆得到两种分别长为1309和1307bp的编码半胱氨酸丰富毒蛋白（cysteine-rich venom protein,CRVP）的全长cDNA序列。这两种crvp基因同源性为97％,分别编码238和199个氨基酸残基,其中包括一段相同的由19个氨基酸残基组成的信号肽。氨基酸序列分析表明,这两种CRVP蛋白与蜥蜴helothermine毒素蛋白以及台湾饭铲倩CRVP毒蛋白高度同源,而且具有半胱氨酸丰富分泌蛋白（cysteine-rich secretory protein,CRISP)家族的典型结构特征。