小拟南芥激素相关基因及GH3.6的克隆与表达

植物激素是植物体内产生的一些微量的、能调节自身生理过程的有机化合物,生长素是一种重要的植物激素,在植物生长发育的过程中起着重要作用。为了探索激素相关基因在短命植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)逆境适应过程中的作用,本研究基于小拟南芥响应高盐胁迫叶片转录组数据库,首先筛选出2156个激素相关基因,包括生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸、油菜素内酯、细胞分裂素及赤霉素相关的基因,其中生长素和脱落酸相关基因所占比例最多并且多为上调表达。进一步通过分层聚类(H-Cluster),K均值聚类(K-means Cluster)和密度聚类(SOM Cluster)分析持续上调的基因,发现一个编码吲哚乙酸酰胺合成酶的基因GRETCHEN HAGEN 3. 6(GH3. 6)在高盐胁迫过程中明显上调表达。采用RT-PCR克隆小拟南芥Ap GH3. 6基因,其开放阅读框长为1839 bp,编码612个氨基酸。系统进化分析表明,Ap GH3. 6与山"菜(Eutrema salsugineum) GH3. 6进化关系最近,属于同一进化分支。转录组数据分析表明在250 m M Na Cl下,Ap GH3. 6持续上调表达;实时荧光定量PCR分析表明Ap GH3. 6在小拟南芥各个组织中均有表达,但在花中表达量最高;高盐胁迫表达分析表明,随着胁迫时间增加,Ap GH3. 6表达量不断升高。为了进一步研究该基因的功能,构建了植物过量表达载体35S∶Ap GH3. 6并转化农杆菌GV3101。本研究为深入分析激素相关基因在小拟南芥响应盐胁迫中的功能机制奠定了基础。     

小拟南芥双键还原酶基因OpDBR的克隆及表达分析

从小拟南芥,又名无苞芥(Olimarabidopsis pumila,异种名Arabidopsis pumila)幼苗叶片c DNA文库中获得1条与拟南芥烯醛双键还原酶基因At DBR1(Gen Bank登录号为NP_197202.2)高度相似的EST序列,该序列包含1个1041 bp的最大开放阅读框(ORF),推测编码346个氨基酸(Gen Bank登录号为KU845686)。利用RT-PCR技术从小拟南芥叶片的c DNA中克隆了该基因,命名为Op DBR。比对分析结果表明,该基因属于中链还原/脱氢酶(medium chain reductase/dehydrogenases,MDR)超级家族,具有double bond reductase-like保守蛋白结构域;该蛋白的二级结构包含106个α-螺旋和48个β-转角。系统进化树分析结果表明,Op DBR编码产物与预测的亚麻芥烯醛双键还原酶(Gen Bank登录号为XP_010492631.1)遗传关系最为接近,属于同一进化分支。实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)结果显示,Op DBR在小拟南芥的不同组织中都有表达,茎中表达量最高,根中最低。其在200 mmol/L Na Cl、4℃、100μmol/L ABA、20%PEG-6000处理下的表达结果分析显示,该基因可能在小拟南芥应对逆境胁迫时起着重要作用。     

短命植物小拟南芥光周期调控基因CONSTANS的克隆与表达特征分析

目的光周期是影响植物生长发育的重要因素之一,CONSTANS (CO)是植物光周期开花途径中关键的基因。方法本研究基于短命植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)转录组数据库,获得1条与拟南芥CO基因At COL1基因序列高度相似的unigene,通过RT-PCR方法从小拟南芥中克隆了该CO同源基因,命名为Ap COL1;进行了基因的生物信息学分析及节律表达、组织表达和响应非生物胁迫的表达特征分析。结果研究结果表明Ap COL1具有两个Bbox和一个CCT结构域,氨基酸序列上与At COL1相似性高达86. 8%。系统进化分析表明Ap COL1与At COL1和琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)的Al COL1亲缘关系较近,且属于第I亚组成员。qRT-PCR实验表明在长日照和短日照条件下Ap COL1具有相似的昼夜节律表达特征; Ap COL1在小拟南芥各组织中均有表达,但在果荚中表达量最高。250 mmol/L Na Cl胁迫和20%PEG-6000模拟干旱胁迫12 h明显抑制Ap COL1基因的表达,并且随着胁迫时间的延长Ap COL1表达水平没有显著差异。在高温(40℃)胁迫下,Ap COL1基因的表达在24 h内先下降后上升并达到最高,48 h又下降到对照水平。低温(4℃)胁迫24 h之前,Ap COL1基因的表达没有明显变化,但处理48 h表达水平显著下降。结论本研究表明Ap COL1基因能够响应盐、干旱、高温和低温等非生物胁迫,暗示该基因在小拟南芥抵抗逆境胁迫中起着重要作用。     

水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及检测

以水稻（粳稻）cDNA为模板,设计一对特异性引物,获得编码水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的全序列,ORF区编码含535个氨基酸的蛋白,具有磷酸盐转运蛋白保守的蛋白激酶C作用位点、N端糖基化位点与酪蛋白激酶Ⅱ作用位点Southern blot分析显示此基因在水稻基因组中具有多个拷贝,与水稻基因组序列分析结果一致Westernblot预测目的基因表达的蛋白大小约为57．7ku．该基因的真核表达研究正在进行中．     

日本囊对虾Na-K-2Cl共同转运蛋白基因的克隆与组织表达分析

利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等技术在鳃组织中获得日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)Na-K-2Cl共同转运蛋白(NKCC)cDNA全序列,包含14bp的5′非编码区(5′-UTR)、201bp的3′-UTR和3 183bp的开放阅读框(ORF).该ORF共编码1 060个氨基酸,预测蛋白分子质量为117.051ku,理论等电点为6.57,命名为Mj-NKCC.预测Mj-NKCC二级结构由10个跨膜区组成,跨膜区的氨基酸序列和布局均相对保守.同源对比结果显示,Mj-NKCC的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾(Halocaridina rubra)的Na-K-2Cl共同转运蛋白相似度最高,为77%.系统进化分析表明Mj-NKCC与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹(Callinectes sapidus)等甲壳动物的NKCC聚为一支.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,Mj-NKCC基因在肝胰腺、鳃、胃、肠、心、眼柄、肌肉和血细胞中均有表达,鳃组织中表达量最高;在盐度骤变时,该基因表达变化显著,表明其很可能参与了对虾的渗透压调节,在对虾的渗透平衡中发挥重要作用.     

拟南芥 AtMYB61基因的克隆及表达载体构建

文章以拟南芥幼苗提取的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得AtMYB61基因的全长cDNA片段,再克隆到pUCm-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了拟南芥AtMYB61基因.从AtMYB61-pUCm-T载体上,用BstEⅡ和BglⅡ全双酶切切下目的基因片段,将此基因片段连接到植物表...     

小拟南芥COR15a基因的克隆及序列分析

拟南芥的CORl5a基因受低温处理、ABA及干旱诱导表达,与植物的低温驯化有关。根据拟南芥序列。利用PCR技术从小拟南芥基因组中克隆了AtCORl5a的同源基因ApCOR15a。2个基因具有相同的结构,ApCORl5a编码139个氨基酸,其序列有84％与AtCORl5a蛋白相同。     

斧翅沙芥蔗糖转运蛋白基因PdSUT4的克隆与表达分析

通过5′和3′cDNA末端快速扩增方法获得PdSUT4基因序列,利用生物信息学软件预测蛋白质理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性,同时用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行PdSUT4基因表达模式分析.结果表明,从斧翅沙芥克隆得到的PdSUT4基因cDNA全长为2005 bp,开放阅读框1536 bp,编码511氨基酸,相对分子质量为55087.44,等电点为9.26,PdSUT4蛋白含有12个跨膜结构域,具有高等植物蔗糖/H~+共转运家族和协助扩散超家族的保守结构域,与多种植物SUT4基因编码的蛋白有较高的一致性;干旱胁迫下斧翅沙芥PdSUT4基因表达量迅速升高.PdSUT4基因的克隆与表达分析为进一步研究该基因在斧翅沙芥生长发育、逆境生理的生物学功能奠定了基础.     

拟南芥CBF基因的克隆

CBFs是拟南芥中能与低温响应元件CCGAC结合的转录因子，通过诱导冷调节基因(COR)的表达从而增强植物的耐冻性。CBFs由一个小的基因家族编码，包括3个成员：CBF1、CBF2和CBF3，在序列上高度相似。我们根据其编码基因的启动子和终止子中的一致序列，设计了一对PCR引物，用一次反应即同时获得了这3个基因的克隆。     

小拟南芥几丁质酶基因cDNA的克隆与序列分析

通过合成1对特异引物，应用RT-PCR技术从小拟南芥总RNA中经反转录克隆出几丁质酶基因，该cDNA基因全长985bp，含有1个963bp的开放阅读框(ORF)，编码321个氨基酸，推测分子量为35．53kD，序列同源性分析表明，该基因与拟南芥几丁质酶基因有93％的同源性。     

小拟南芥ApCBF基因的克隆及转化烟草的初步研究

CBF是植物冷驯化过程中的关键性调节因子。利用PCR及染色体步移法从新疆特有拟南芥近源种植物——小拟南芥的基因组中克隆了CBF基因的同源序列（DQ207404）。生物信息分析表明,该序列具有完整的读码框,推定的蛋白质序列与拟南芥CBF1,2,3的相似性分别为：87．6％、86．6％和88．1％。以植物表达载体pBI121为基础,构建了由组成型启动子35S调控ApCBF的植物表达载体pCB111。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR检测初步证明却ApCBF基因已整合到烟草基因组中。为利用ApCBF基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

新疆小拟南芥ApCBF1基因的克隆及其过量表达转基因的研究

利用同源克隆法,克隆了小拟南芥的CBF1基因的cDNA（FJ491244）,比对分析结果表明,ApCBF1的cDNA序列的A252,在拟南芥的AtCBF1的cDNA是T252,但翻译的氨基酸均是Ala,表明ApCBF1和AtCBF1翻译的氨基酸序列完全一致。构建了过量表达载体：p35S：ApCBF1,通过花滴法转入小拟南芥中。RT-PCR检测结果表明,转基因T0代AtCBF1基因过量表达。     

蚕豆类水孔蛋白基因的克隆及表达

为了解水孔蛋白在气孔运动中的作用,通过5′/3′RACE(rapid amplification of cDNAends)技术从蚕豆(Vicia fafba)叶片表皮cDNA中克隆出1个编码290个氨基酸的类水孔蛋白基因VfPIP1(Vicia faba plasma membrane intrinsic protein gene),GenBank登录号为AY667436.应用计算机软件对VfPIP1的氨基酸序列分析表明,VfPIP1含6个跨膜区,具有质膜水孔蛋白的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN,属于PIP1亚家族成员.原位杂交及Northern blot分析显示,VfPIP1在保卫细胞中有较强的表达信号,并受脱落酸(ABA)诱导.上述结果为研究水孔蛋白VfPIP1在气孔运动中的作用及其活性调节机制打下了基础.     

拟南芥Formin家族蛋白AFH14基因的克隆及功能结构域分析

应用RT-PCR的方法从拟南芥cDNA中克隆了AFH14的全序列,并对其功能结构域进行分析。发现所克隆的目的基因编码区全长3 102 bp,与基因组序列比对发现该基因包含18个内含子和18个外显子,编码1 033个氨基酸残基。通过与其它formin成员的序列比对分析,发现AFH14是一个典型的拟南芥II型formin,包括PTEN结构域。     

小拟南芥液泡膜H~+-PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性起着重要的作用。为了克隆小拟南芥液泡膜H+-PPase基因,采用RT-PCR结合RACE的方法从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了1个液泡膜H+-PPase基因,命名为OpVP1。OpVP1基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP1蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6%、98.4%。系统进化分析表明OpVP1基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP1蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP1蛋白是由2个单体组成的二聚体蛋白。qRT-PCR表明OpVP1基因在角果中表达高于根、茎、叶和花中的表达。     

小反刍兽疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表达

根据GenBank报道的小反刍兽疫病毒(PPRV)融合蛋白(F)基因序列,用特异性引物对PPRV疫苗株F蛋白基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果表明:F基因ORF全长1641 bp,编码546个氨基酸;推导的氨基酸序列中第1~18位氨基酸构成信号肽序列,第488~510氨基酸为跨膜区。构建原核表达载体pETF1和pETF2,转化E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blotting的分析结果表明,F1和F2基因在大肠杆菌中均获得了表达,且均具有良好的反应原性。用Ni-NTA试剂盒纯化F1和F2重组蛋白,为研发检测PPRV特异性抗体的诊断试剂奠定了基础。     

编码普通野生稻磷酸盐转运蛋白基因片段的分离与克隆

以云南普通野生稻基因组DNA为模板，根据GeneBank中登记的编码小麦高亲和力磷酸转运蛋白基因保守序列设计一对特异引物，利用多聚酶链反应技术（PCR），扩增出目标基因（cwrpt)1002bp长度的基因片段并克隆到载体pGEM-T。经DIG标记探针杂交检测初筛，限制性内切酶酶切，PCR扩增，DNA序列分析与可能氨基酸序列同源性比较，此推定的氨基酸序列与小麦，水稻，拟南芥，番茄磷酸转运蛋白同源性很高，初步认为此基因片段为普通野生稻耐低磷胁迫相关磷酸盐转运蛋白的编码基因，获得全长序列与基因表达的进一步研究正在进行中。     

新疆小拟南芥NAC转录因子ApNAC055的克隆及表达分析

本研究从新疆特色植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)盐胁迫转录组数据结果中,得到1条与拟南芥NAC转录因子ANAC055(Gene Bank登录号为AEE75683.1)序列高度相似的Unigene。根据ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术从小拟南芥叶片c DNA中克隆了该基因的coding sequence(CDS),命名为Ap NAC055。生物信息分析结果表明,Ap NAC055蛋白是1个无跨膜区域的亲水性蛋白,N端具有一段No apical meristem(NAM)保守结构域;该蛋白二级结构包含73个α-螺旋和33个β-转角。系统进化分析结果表明,Ap NAC055与芜菁NAC055进化关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析结果显示,Ap NAC055在小拟南芥各组织中均有表达,在叶片和果荚中表达量均较高,尤其在果荚中;盐胁迫处理可明显诱导Ap NAC055的表达。本研究表明,Ap NAC055可能在小拟南芥耐盐中起重要作用。     

高亲和力钠离子依赖二羧酸转运蛋白基因的克隆、表达及亚细胞定位研究

为了研究高亲和力钠离子依赖二羧酸转运蛋白(high affinity sodium-dependent dicarboxylate transporter,SDCT2,NaDC3)的功能,从小鼠肾组织中克隆出了其cDNA基因,并对其结构特征、基因表达谱及细胞内定位情况进行了分析。结果显示NaDC3蛋白由600个氨基酸组成,同源性分析表明其氨基酸序列与大鼠及人NaDC3分别有97％和87％相同。二级结构分析显示,该蛋白有13个跨膜α-螺旋区。Northern杂交显示该基因可在肾、肝、脑、胎盘等多种组织中表达。激光共聚焦显微镜观察显示该蛋白定位于肾小管上皮细胞膜上。