赤狐ESR1基因启动子的克隆及生物信息学分析

对赤狐ESR1基因启动子区转录因子结合位点进行了预测,为今后研究其转录调控机制提供参考依据.以赤狐基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增克隆ESR1基因启动子序列,并构建至双荧光素酶报告基因载体;利用生物信息学方法对ESR1基因核心启动子区的关键转录因子结合位点进行预测.成功克隆出赤狐ESR1基因5'上游1880 bp...     

大鼠Neuritin mRNA鉴定、编码序列及蛋白结构分析

为探讨一种新型的神经营养因子,Neuritin在神经系统成熟及其损伤后的再生修复过程中发挥着重要的调节作用。为了获得大鼠Neuritin基因转录本及其蛋白结构的基础数据,本研究利用比较基因组学分别设计与小鼠2个转录本同源的引物,采用RT-PCR的方法钓取大鼠Neuritin基因。采用生物信息的方法对大鼠Neuritin的序列同源性及蛋白结构进行全方位分析。结果表明,大鼠只存在一个Neuritin转录本,编码142个氨基酸,与其他动物的编码序列高度同源;三级蛋白结构分析结果显示大鼠Neuritin蛋白富含有α螺旋,其结构和理化性质无异于人类Neuritin基因。由此可知,本研究首次厘定了大鼠Neuritin mRNA,其蛋白质结构的深入分析也为进一步理解大鼠Neuritin基因的生理功能奠定了基础数据。     

Kas基因启动子区的克隆及功能初步分析

利用TAIL-PCR技术,克隆到了与辣椒素合成有关的胎座特异表达基因——3-酮酯酰．ACP合成酶基因（Kas）上游400bp的调控区域．将其全长片段与GUS基因连接构建植物表达载体并转化烟草．GUS组织化学染色表明,克隆到的440bp片段具有启动子活性．对该片段进行序列分析发现,在起始密码子ATG上游存在2个TATA-box,分别为-316～-311位的TATAAA和-224～-219位的TATAAA;在TATA-box上游还存在1个位于-378～-374处的CAAT-box,序列为CCAAT．该研究旨在为利用基因调控辣椒素的生物合成,提高辣椒果实中的辣椒素含量奠定基础．     

NAP1基因和ARHP基因启动子区的生物信息学分析

采用进化足迹法,利用生物信息学在线软件,分析了鼻咽癌相关肽基因NAP1和成人视网膜假定蛋白基因ARHP的启动子结构,在人和小鼠NAP1基因的启动子保守区内预测出38个共同的转录因子结合部位,在人和小鼠ARHP基因的启动子保守区内预测出44个共同的转录因子结合部位,分析结果为NAP1基因和ARHP基因调控区的分析与鉴定,基因表达调控机制的研究提供了重要的参考.     

人IDE基因启动子生物信息学分析

对人IDE基因启动子进行生物信息学分析以获得人IDE基因启动子、CpG岛及转录因子结合位点特征.从UCSC基因组数据库成功获得人IDE基因5’调控区2 000 bp序列.Promoter 2.0、FPROM、NNPP预测人IDE基因分别有3个、2个、6个启动子.Relative profile score threshold选择80%、85%、90%、95%、100%时,JASPAR预测该序列存在5170、1771、454、87和5个可能的转录因子结合位点.Relative profile score threshold选择80%,搜索到6个潜在的TCF7L2转录因子结合位点.采用进化足迹法,LAGAN预测方法获得位于人和小鼠同源IDE基因启动子保守区域相同位置的转录因子结合位点为14个,包含转录因子SPI-1、cap、c-FOS、FREAC-3、c-ETS、Cdxa、HSF2等.发现一个CpG岛,位于1 303～1 705 bp 之间,大小为403 bp.人IDE基因启动子、CpG岛及转录因子结合位点的生物学信息学分析,为下一步基因表达调控实验奠定了基础.     

Pinb基因启动子生物信息学分析及载体构建

运用生物信息学预测并分析小麦硬度基因Pinb的启动子,利用无缝克隆构建胚乳特异表达载体.采用生物信息学软件预测Pinb基因5’端上游调控区3056bp序列进行启动子预测与分析,克隆启动子,利用无缝克隆技术构建Pinb基因的胚乳特异表达的重组质粒,重组质粒经测序鉴定构建正确.Pinb基因5’上游-3060bp至-4bp区域内存在启动子活性,在-2419bp至-500bp间启动子活性分值均在0.8以上,其中-550bp至-500bp区启动子片段分值最高,达到0.99.在-2862bp处和-362bp处各有一个转录起始位点.在-544bp处有一个CAAT盒信号,在-541bp处有一个TATA盒信号.在-2362bp至-2256bp、-1704bp至-1559bp和-537bp至-361bp处各有一个CpG岛.取最有可能的757bp(-803bp至-47bp)启动子片段构建重组质粒(LBLV232),质粒经酶切和测序验证正确.最终,成功构建Pinb基因启动子报告基因表达载体,为系统研究该基因启动子活性提供前期基础.     

藏鸡THRSP基因的克隆及生物信息学分析

对藏鸡THRSP基因进行克隆、序列测定及生物信息学分析.结果表明:获得的藏鸡THRSP基因核苷酸序列为428 bp(GenBank登陆号:KT153607),在50-258 bp处存在1个CpG岛,ORF长度为390 bp,编码129个氨基酸,其中Leu所占比例为10.9％.THRSP蛋白分子量为14.18 ku,等电点(pI)为4.61,属于不稳定酸性核蛋白,存在8个磷酸化位点和5个O糖基化位点.预测其二级结构中α螺旋占51.2％,β折叠占3.1％,无规则卷曲占45.7％.同源性分析结果表明:藏鸡与原鸡THRSP基因核苷酸及预测的氨基酸序列同源性为100％,两者亲缘关系最近.     

慈竹CCoAOMT基因的克隆及生物信息学分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶是木质素生物合成过程中的关键酶之一。该研究以慈竹嫩茎为材料,采用RT-PCR及RACE方法,克隆CCoAOMT基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明:1个慈竹CCoAOMT基因cDNA全长序列被成功克隆,该序列全长为1 080 bp,含有1个777 bp的读码框,编码了1个包含258个氨基酸的蛋白质,分子质量约为28.861 ku,等电点为5.33,二级结构中α-螺旋占42.25%,β-转角占8.91%,延伸链占15.89%、无规则卷曲占32.95%。对氨基酸多序列比对发现,慈竹与绿竹的CCoAOMT1基因亲缘关系最近,但慈竹CCoAOMT基因编码的氨基酸与绿竹相比,在第10位点上发生了缺失,5个位点发生了变异。慈竹、绿竹、毛竹、玉米CCoAOMT基因编码的氨基酸中都含有1个相对保守的无序化区域。NaC-CoAOMT1基因组织表达结果表明,其在未展开叶、笋上部和中部、茎的上部和中部的表达量较高。笔者将克隆并获得的慈竹木质素合成酶CCoAOMT基因全长序列(GenBank注册号为JF742462)命名为NaCCoAOMT1,分析认为其可能与慈竹木质素生物合成有关。     

阳春砂HMGR基因cDNA克隆及生物信息学分析

目的:克隆阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的编码区c DNA.方法:根据阳春砂叶片转录组得到的HMGR基因序列自主设计引物.用改良的CTAB法提取阳春砂叶片总RNA,反转录得到c DNA,以c DNA为模板通过PCR反应扩增阳春砂HMGR基因并克隆到p MD-18T载体,将获得的阳性克隆进行测序分析.运用生物信息学方法分析得到的c DNA序列.结果:成功扩增出全长1 716 bp的c DNA片段,将其成功克隆进入p MD-18T载体,测序后将序列提交至Gen Bank得到其编号KU572444.生物信息分析结果显示,该基因片段编码1个由571个氨基酸残基组成HMGR蛋白.HMGR二级结构主要由43.95%的α-螺旋和47.29%的β-转角组成,同时还含有8.76%的β-折叠.与其他植物该蛋白质序列同源性及进化树分析结果表明,阳春砂HMGR与小米(Setaria italic)的同源性最高,且阳春砂与单子叶植物聚为一类.结论:从阳春砂叶片中成功克隆HMGR基因并进行了生物信息学分析.     

水稻OsPPDK基因的克隆及生物信息学分析

利用比较基因组学方法,通过小麦TaNAM基因序列来设计引物,在早衰水稻品系金23B中寻找TaNAM的同源基因.对获得的c DNA片段进行序列比对分析,发现其与丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate phosphate dikinase,PPDK)基因高度同源,因此将其命名为OsPPDK(Oryza sativa PPDK).为进一步探索OsPPDK基因的功能及其与叶片衰老的关系,根据水稻预测OsPPDK基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆出OsPPDK基因的编码区,并进行生物信息学分析.结果表明:该基因全长为3 515 bp,包含一个完整的ORF,编码区长2 844 bp,编码947个氨基酸,分子量为102. 79 k D,所编码的氨基酸序列与其他已知的植物来源的PPDK基因相比,相似性大多在80%以上.在PPDK基因所编码的氨基酸序列中,发现了一个PEP利用酶位点信号,3个N-糖基化位点和15个酪蛋白激酶II磷酸化位点,12个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪氨酸激酶磷酸化位点和一个PEP利用酶位点.同时推测出多肽链中有规则重复的构象,并同源建模PPDK蛋白整条肽链的三维空间结构.     

猪hnRNPK基因启动子的克隆及序列分析

首次克隆了猪hnRNPK基因启动子序列,并进一步对该序列进行了分析.结果显示:该基因启动子约1 kb,与已报道的人的相应序列相似度为78.9%,具有相同的"TCTCGCGAGA"核心启动子序列和转录起始位点.利用在线软件分析发现,猪hnRNPK基因启动子不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区,存在两处CpG岛,具有SP1、UCE.2、GCF、EARLY-SEQ1、TTR_inverted_repeat、NGFI-C、EARLY-SEQ1等多种转录因子潜在结合位点,并且具有8种基序结构.     

羊草LVAP1基因的克隆及生物信息学分析

克隆羊草VHA-c基因并预测其编码蛋白质结构和功能.由羊草总RNA经RACE克隆获得VHA-c基因cDNA,采用生物信息学方法预测蛋白结构和功能.获得羊草VHA-c基因cDNA,命名为LVAP1基因(GenBank登录号为GQ397276),LVAP1基因开放阅读框为498 bp,编码165个氨基酸,有4个α-螺旋跨膜结构域,在第4个结构域上含有一个高度保守的G lu142残基,推测它是质子的结合位点.进化树分析显示,羊草LVAP1蛋白与小麦、碱蓬和冰叶日中花等植物的VHA-c蛋白具有高度的同源性,推测LVAP1亚基与其他VHA-c亚基执行相似的功能.     

猪hnRNPK基因启动子的克隆及序列分析

首次克隆了猪hnRNPK基因启动子序列,并进一步对该序列进行了分析.结果显示:该基因启动子约1 kb,与已报道的人的相应序列相似度为78.9%,具有相同的"TCTCGCGAGA"核心启动子序列和转录起始位点.利用在线软件分析发现,猪hnRNPK基因启动子不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区,存在两处CpG岛,具有SP1、UCE.2、GCF、EARLY-SEQ1、TTR_inverted_repeat、NGFI-C、EARLY-SEQ1等多种转录因子潜在结合位点,并且具有8种基序结构.     

白桦BpMYB2基因及其启动子克隆、表达分析

克隆了1条白桦MYB转录因子基因,命名为BpMYB2。实时定量PCR分析表明BpMYB2基因在白桦不同器官和组织内的表达量不同,在直立木木质部中表达量最高,其次是人工弯曲处理2周的对应木、应拉木、花序,在叶和芽中表达量极低; 利用染色体步移技术,获得长度为1 284 bp的启动子序列。启动子进行PLACE分析发现,序列中含有TATA box、ARR1AT、WRKY71OS等元件。构建了由BpMYB2启动子驱动GUS报告基因在植物中的表达载体,命名为BpMYB2-1301,利用农杆菌介导法瞬时转化白桦幼苗,并进行组织化学染色。结果表明:BpMYB2的启动子具有启动子活性,能够驱动GUS基因在白桦中表达; GUS瞬时表达信号在茎、叶柄中较强,在叶片中较弱,说明BpMYB2基因与白桦木质部发育相关。     

人NLK上游启动子区的克隆与鉴定

初步鉴定并分析NLK上游启动子,为研究其转录调控打下基础。对NLK基因翻译起始位点上游约1 958 bp的序列分别进行生物信息学分析,以PCR技术扩增以上序列并测序。将PCR所得到的NLK上游片段进一步克隆到PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒PGL-3basic-luc。通过荧光素酶报告基因实验检测上述启动子的活性。成功构建了包含NLK基因上游启动子序列的荧光报告系统,经荧光素酶报告基因实验证明该重组质粒体具有转录活性。构建的NLK基因上游启动子报告基因载体为进一步研究NLK基因的转录调控机制奠定了基础。     

中度嗜盐菌GbsB基因的克隆、序列分析及生物信息学分析

为构建耐盐的转基因植物提供材料,根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisATCC 14580的GbsB基因的核甘酸序列设计1对特异性引物,通过PCR的方法扩增由分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsB基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,采用NCBI-BlastX软件在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:得到的GbsB基因的开放阅读框(ORF)全长为1209bp,编码1个由402个氨基酸残基组成的蛋白质;其与Bacillus licheni-formisATCC 14580的GbsB基因的氨基酸序列同源性高达96%。生物信息学分析表明:该GbsB基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个乙醇脱氢酶作用位点。     

中华按蚊GSTO1基因的鉴定及生物信息学分析

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是有机体内一类具有解毒和抗氧化等多功能的超家族蛋白酶。在昆虫中GST主要分为七大家族,Omega家族(GSTO)为研究较少的家族。在本研究中,通过Blast方法搜索中华按蚊(Anopheles sinensis)转录组数据,得到中华按蚊GSTO1cDNA序列,全长1 059bp,其中阅读框ORF长744bp,编码248个氨基酸。推测该基因编码蛋白的分子量和等电点分别为28.5kD和6.92。分析发现该蛋白不存在跨膜区和信号肽,亚细胞定位预测显示该蛋白质位于细胞质中。同源性分析表明GSTO1蛋白与达氏按蚊(Anopheles darlingi)氨基酸序列相似性最高。本研究进一步丰富了GST蛋白的基础数据,为进一步研究昆虫GSTO蛋白的功能奠定了理论基础。     

中华按蚊AsAce2基因的鉴定及生物信息学分析

【目的】对中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中的乙酰胆碱酯酶(Ace)基因进行鉴定和生物信息学分析。【方法】通过同源性搜索得到1条乙酰胆碱酯酶(Ace)基因序列,命名为AsAce2,分析了该基因的基因结构以及所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、二级结构、三级结构和系统发生关系。【结果】AsAce2基因全长为4 008bp,编码区序列长度为1 941bp,共编码647个氨基酸;AsAce2蛋白与其他蚊虫的Ace2蛋白具有较高的同源性,在系统发育关系上与冈比亚按蚊(Anopheles stephensi)的Ace2蛋白和不吉按蚊(Anopheles gambiae)的Ace2蛋白关系更近;AsAce2基因结构中含有3个1位和2个2位内含子;AsAce2蛋白分子式为C_(3222)H_(4925)N_(875)O_(947)S_(32),为亲水性蛋白,蛋白定位在细胞周质,在13~32位氨基酸为跨膜区,无疏水区和信号肽,二级结构主要以不规则卷曲为主。【结论】丰富了相关基础数据,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。