棉花硫氧还蛋白基因GhWCRKC2-5参与开花调控的功能研究

目的 FLOWERING LOCUS T (FT)位于开花调控网络的中心,编码成花激素,不仅调控植物开花转变,还参与调控植物多方面的生长发育。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)在植物的逆境胁迫中发挥着重要的生物学功能。方法我们前期克隆了一个棉花FT同源基因Gh FT1,利用酵母双杂技术筛选到一个与Gh FT1蛋白互作的硫氧还蛋白Gh WCRKC2-5。本研究采用RT-PCR技术从陆地棉中扩增了Gh WCRKC2-5基因的开放阅读框c DNA。该基因编码一个203个氨基酸的短肽,含有WCRKC保守氨基酸基序,为非典型的Trx。全基因组分析表明棉花中含有46个非典型的Trxs,系统进化分析显示Gh WCRKC2-5与Theobroma cacao的Tc WCRKC亲缘关系最近。q RT-PCR分析表明Gh WCRKC2-5基因在棉花根和花中表达较高,在茎、叶和顶端分生组织中表达较低;在纤维不同发育时期,Gh WCRKC2-5基因表达呈现出降低-升高-降低的趋势,在棉花开花后25 d时的纤维表达最高。结果在拟南芥中过量表达Gh WCRKC2-5基因,转基因拟南芥明显比野生型早花,并且转基因拟南芥的FT及开花通路中关键基因SUPPESSOR OF OVER EXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1)明显上调表达。利用病毒介导的基因沉默技术干扰Gh WCRKC2-5基因的表达,Gh WCRKC2-5沉默的植株比对照植株开花时间晚。结论 Gh WCRKC2-5基因在棉花的开花转变中起着重要作用,本研究为深入分析棉花开花调控机理奠定基础。     

棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因的克隆和功能初步分析

DELLA蛋白是赤霉素信号途径的负调节因子,在棉花纤维发育中有着重要作用。本研究采用同源克隆方法,从棉花中克隆DELLA蛋白Gh GAI2b基因,构建p BP35S:Gh GAI2b和p BP35S:Ghgai2b植物过表达载体,通过农杆菌介导的滴花法转化Col野生型拟南芥。结果表明,棉花DELLA蛋白Gh GAI2b包含了DELLA蛋白家族中所有的典型保守区域;转基因拟南芥表现出莲座叶半径变短,植株矮化,花序紧凑,花器官发育迟缓等生长发育受抑制表型。说明棉花DELLA蛋白Gh GAI2b基因可能参与GA信号途径抑制植物生长发育。     

棉花色氨酸脱羧酶GhTDC基因促进烟草BY2细胞的伸长

色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase,TDC)在生长素(Indoleacetic acid,IAA)合成和植物器官发育等过程中发挥重要作用,其参与纤维发育的研究现有报道。本研究将陆地棉Gh TDC基因转化烟草BY2悬浮细胞,分析TDC在细胞伸长发育过程中的功能。本研究采用RT-PCR方法从陆地棉胚珠和纤维组织中克隆得到Gh TDC基因,该基因的c DNA全长包含完整开放读码框为1491 bp,编码497个氨基酸的多肽,理论分子质量为54.67 ku。生物信息学分析结果表明,Gh TDC蛋白是一个亲水性蛋白,其含有磷酸吡哆醛结合位点和催化结构域。进化树分析结果表明,棉花Gh TDC与黑升麻Ar TDC的亲缘关系上较近。构建原核表达载体p ET32a-Gh TDC并转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,获得分子质量约为54 ku的重组蛋白,重组蛋白具有较高的酶催化活力。q RT-PCR结果分析结果表明,Gh TDC基因在纤维突起时期的开花前3 d和纤维快速伸长发育时期的开花后5-15 d表达丰度较高。将Gh TDC转基因转化烟草BY2悬浮细胞,烟草悬浮细胞的伸长发育获得了显著促进。本研究结果为研究Gh TDC基因在细胞伸长发育过程中的重要调控作用提供了参考。     

棉纤维细胞色素单加氧酶基因GhCYP714A1促进活性氧的累积

本研究利用RT-PCR技术从陆地棉纤维组织中克隆得到了1个棉花细胞色素P450基因(Cytochrome P450714A1)的全长c DNA序列,将该基因命名为GhCYP714A1。序列分析发现,该cDNA包含1563 bp的完整开放读码框,编码521个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为57.31 kDa;氨基酸序列生物信息学分析显示,Gh CYP714A1蛋白具有跨膜结构域和多个蛋白结合位点;进化树分析结果表明,棉花Gh CYP714A1与禾草SiCYP714B1在进化上亲缘关系上较近;半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhCYP714A1基因与纤维突起形成发育有关。本研究构建了pET28a-GhCYP714A1原核表达载体并进行体外诱导表达,获得分子质量约为57.31 kDa的重组蛋白。将GhCYP714A1基因转化烟草验证其参与活性氧产生的功能,与非转基因的野生型烟草相比,转基因烟草叶片中具有较高的H_2O_2累积。本实验结果为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。     

棉纤维醛酮还原酶基因促进拟南芥主根伸长

为了研究棉纤维醛酮还原酶基因在参与细胞伸长发育中所起的作用,本研究利用RT-PCR技术从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到棉花醛酮还原酶(aldo/keto reductase,AKR)基因c DNA,该基因全长读码框为1134 bp,编码377个氨基酸。氨基酸序列生物信息学分析表明Gh AKR蛋白具有较高的保守性,包含氧化还原酶、醛酮还原酶结合位点和跨膜信号序列等功能序列和位点;进化树分析显示Gh AKR与可可(Tc AKR)的亲缘关系较近。q RT-PCR和酶活性分析表明Gh AKR基因与纤维细胞的快速伸长发育密切相关,尤其在开花后5-15 d纤维快速伸长发育时期具有较高的表达。构建35S::Gh AKR过量表达载体并转化野生型拟南芥(哥伦比亚生态型),转基因拟南芥的主根伸长发育获得了显著的促进,与野生型相比,转基因拟南芥主根伸长增加了约1.4倍。拟南芥根中甲醇和乙醇含量分析显示,转基因拟南芥根中具有较高的甲醇和乙醇积累。这些结果表明棉纤维Gh AKR基因与纤维细胞伸长发育联系紧密,可能通过增加细胞内的醇含量进一步促进细胞的伸长。本研究可为棉花Gh GAKR基因参与纤维伸长发育分子机制解析,以及利用基因工程培育优质棉花品种提供一定参考。     

棉花G.LEC1A基因的克隆和鉴定

为了研究棉花LEC1基因的功能,本研究采用同源克隆方法从海岛棉中克隆棉花LEC1基因(G.LEC1A),构建p CAMG.LEC1A植物表达载体,用农杆菌蘸花法转化拟南LEC1缺失突变体lec1-1,通过干燥筛选方法检验LEC1功能恢复情况。结果表明:G.LEC1A基因的ORF全长为627 bp,编码208个氨基酸,具有LEC1蛋白家族保守的B结构域。组成型表达G.LEC1A可恢复拟南芥lec1-1突变体种子的干燥耐受性。研究结果说明,棉花LEC1A基因是拟南芥LEC1的同功基因。     

拟南芥RabA2b互作蛋白的筛选与鉴定

Rab蛋白家族在调控细胞囊泡的运输过程中发挥着重要作用.拟南芥中存在数量庞大的RabA亚族成员,它们参与调控植物不同阶段的生长发育过程.为了寻找拟南芥RabA亚族下游的调节蛋白或效应蛋白,进而阐明RabA在细胞活动中的角色,本研究选取RabA2b蛋白进行了深入研究.本研究首先构建过表达RabA2b的拟南芥植株,同时结合免疫共沉淀方法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测到多个Hsp70蛋白家族成员与RabA2b蛋白共沉淀.为了进一步研究Hsp70成员与RabA2b的相互关系,将5个细胞质和细胞核定位的Hsp70s蛋白分别构建于植物表达载体,通过在烟草叶表皮细胞中瞬时表达Hsp70s和RabA2b发现它们共定位于细胞质膜、细胞质以及细胞核周围的丝状结构.同时,体外pull-down实验证明了5个Hsp70s蛋白都能与RabA2b蛋白直接相互作用.此外,双分子荧光互补实验(BiFC)进一步证实了Hsp70s与RabA2b在烟草叶表皮细胞中的相互作用,说明拟南芥中细胞质和细胞核定位的Hsp70s可以作为RabA2b的调节蛋白或效应蛋白一同调控植物的生长发育过程.     

苦荞CCT基因家族生物信息学及表达分析

CCT转录因子在调控植物花期、生长发育及抗非生物胁迫等方面发挥着重要的功能。本研究以拟南芥AtCCT基因家族为参考序列,利用本地BLAST并结合保守结构域等生物信息学工具,筛选出苦荞FtCCT基因家族成员,并对其理化性质、染色体分布、基因结构、系统进化及表达水平进行分析。结果显示:从苦荞中共鉴定出35个FtCCT基因,含1-8个内含子;编码蛋白有117-753个氨基酸残基,等电点为4.96-9.51,均为亲水性蛋白。染色体定位分析表明,这些基因在8条染色体上均有分布。苦荞FtCCT基因家族含有10个保守基序和5个保守结构域,且都含有CCT保守结构域。系统进化分析表明,苦荞的FtCCT基因家族与拟南芥一样可分为3个亚家族,其中CMF亚家族的成员最多。35个FtCCT基因在苦荞根、茎、叶和花中的表达水平具有差异性,在叶和花中具有高表达量的成员较多,只有少数的成员在根和茎中高表达。本研究为进一步解析CCT基因调控苦荞花期及生长发育奠定基础。     

根癌农杆菌法转化烟草的条件探索

 利用含有四环素阻遏蛋白,具有卡娜霉素抗性的烟草种子为实验材料,采用根癌农杆菌介导转化中的叶圆盘法,将外源基因导入烟草愈伤组织,建成可诱导表达细胞质和细胞核CaM/CaM结合多肽的转基因烟草体系.在获得转基因植物的过程中,通过比较影响根癌农杆菌转化频率的各种因素,表明植物材料的选择和培养,农杆菌的培养和稀释,植物材料与农杆菌共培养的程度及转基因植株的筛选条件是影响农杆菌转化效率的重要因素.     

小黑麦NAC转录因子基因TwNAC01克隆及生物信息学分析

NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)是在调控植物发育、衰老、生物与非生物逆境以及激素反应等方面具有重要作用的一类转录因子。为探索六倍体小黑麦耐干旱机制,本研究以六倍体小黑麦为材料,利用快速扩增cDNA末端(RACE)与反转录·聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆到1条NAC转录因子cDNA全长,分析了其生物信息学特点,同时利用实时定量PCR技术分析其在干旱胁迫下的组织部位表达特点。结果表明,所克隆小黑麦基因ORF全长1 059 bp,编码352个氨基酸。该基因预测蛋白中具有NAM亚家族保守的氨基酸序列,且其预测蛋白氨基酸序列与山羊草中的NAC转录因子氨基酸序列同源性高达90%以上。该基因预测蛋白属亲水性蛋白,无跨膜结构域与信号肽区域,二级结构包含45个α-螺旋,57个β-折叠和250个无规则卷曲。预测蛋白定位于细胞核内。在干旱胁迫下,该基因在开花后22 d的小黑麦幼粒和根部的表达量明显高于茎和叶,且表达量显著受干旱胁迫诱导。可见所克隆的基因为小黑麦NAC转录因子,将其命名为TwNAC01(GenBank登录号为MG736919),其在小黑麦抗旱应激反应中具有重要作用。小黑麦NAC转录因子基因TwNAC01的克隆对于揭示小黑麦的抗旱性机制以及小黑麦抗旱基因工程育种具有重要意义。     

竹叶花椒TPS基因家族全基因组分析

为了探究香料植物TPS基因家族的潜在功能,本研究以香料植物竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC.)为材料,利用生物信息学方法对其萜类合成酶基因家族的理化性质、基因重复类型、亚细胞定位、进化关系、染色体定位与共线性、基因结构和基因表达进行了系统地分析.我们在竹叶花椒全基因组中共鉴定到53个TPS基因家族成员,它们编码蛋白氨基酸长度为173～859 aa,分子量为20.21～98.44 kDa,等电点范围在4.87～9.10,主要定位于细胞质和叶绿体当中.进化分析显示,ZaTPSs可以划分为6个亚家族,TPS-a和TPS-b亚家族的成员最多.其中48个成员都包含TPS家族的保守基序motif1.染色体定位与共线性分析显示,53个成员在11条染色体上不均匀分布,存在4处串联重复,共线性分析证明竹叶花椒与其同科物种甜橙[Citrus sinensis(L.) Osbeck]的TPS基因有更近的基因进化关系.基因表达差异分析显示,ZaTPSs有一定的组织表达特异性,在幼花中表达量最高,其次是果皮.这些研究结果表明TPS基因家族在竹叶花椒果皮挥发油的合成和防御等方面发挥了重要作用...     

SUN-domain蛋白家族在植物中的研究进展

SUN-domain蛋白家族是植物细胞膜上核骨架与细胞骨架连接复合体(LINC)的重要组成成分,在细胞核的形态、定位和迁移以及染色体移动和配对的过程中均发挥着重要作用.由于功能域在编码基因中所在位置不同,SUN-domain蛋白家族可以分为羧基端SUN-domain蛋白(Cter-SUN)亚家族和中间SUN-domain蛋白(Mid-SUN)亚家族. Cter-SUN蛋白定位于内核膜上,而Mid-SUN蛋白在核周质、内质网上均有出现.受基因复制事件和选择性剪切事件的影响,SUN-domain蛋白家族在不同植物中的成员数目和功能作用也存在一定的差异.从系统进化上来看,SUN-domain蛋白家族的起源古老,可能出现在单细胞生物进化为多细胞生物之前.根据目前对植物SUN-domain蛋白的理解,文章阶段性总结了该蛋白家族在植物各主要类群中的成员组成、编码基因的特点和表达模式以及各蛋白的功能特性等方面的研究进展,为深入理解该蛋白家族在植物进化中的作用奠定了基础.     

中华按蚊GSTO1基因的鉴定及生物信息学分析

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是有机体内一类具有解毒和抗氧化等多功能的超家族蛋白酶。在昆虫中GST主要分为七大家族,Omega家族(GSTO)为研究较少的家族。在本研究中,通过Blast方法搜索中华按蚊(Anopheles sinensis)转录组数据,得到中华按蚊GSTO1cDNA序列,全长1 059bp,其中阅读框ORF长744bp,编码248个氨基酸。推测该基因编码蛋白的分子量和等电点分别为28.5kD和6.92。分析发现该蛋白不存在跨膜区和信号肽,亚细胞定位预测显示该蛋白质位于细胞质中。同源性分析表明GSTO1蛋白与达氏按蚊(Anopheles darlingi)氨基酸序列相似性最高。本研究进一步丰富了GST蛋白的基础数据,为进一步研究昆虫GSTO蛋白的功能奠定了理论基础。     

毛白杨果胶甲酯酶PtoPME34-1调控植物抗旱性研究

为了探究林木植物中果胶甲酯酶PME的功能,本研究中,我们从毛白杨中克隆出拟南芥PME34的同源基因PtoPME34-1,阐述了该基因在毛白杨中的生物学功能.生物信息学分析表明,毛白杨PtoPME34-1基因与毛果杨PtrPME34-1序列相似性为100%,与拟南芥AtPME34序列相似性为93%.组织特异性表达分析显示PtoPME34-1基因在所有组织都有表达,在基部茎、木质部的表达量较高,在老叶表达量最低.蛋白亚细胞定位结果显示,绿色荧光蛋白GFP标记的PtoPME34-1-GFP融合蛋白定位在烟草叶片细胞壁.毛白杨PtoPME34-1基因过表达显著提高植株的抗旱性.毛白杨PtoPME34-1和PtoPME34-2基因的双突变体植株中果胶甲酯化程度升高,且植物抗旱性也显著增加.这些研究结果证实PtoPME34-1在调控植物生长发育和抗旱胁迫中发挥重要作用.     

拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究

探讨了拟南芥的翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位.以Col野生型拟南芥的cDNA为模板,通过高保真KOD扩增酶获得2 363bp的拟南芥转录延伸因子EF1A基因片段,将其与GFP融合后共同连入p1300表达载体,利用农杆菌侵染法将p35S∶GFP和p35S∶EF1A∶∶GFP转入野生型拟南芥中,观察转基因植物细胞中GFP的表达情况.结果显示:p35S∶GFP转基因植物中,细胞核中GFP荧光强度显著高于细胞质中荧光强度,但是在p35S∶EF1A∶∶GFP转基因植物中,细胞核中荧光强度与细胞质中荧光强度无显著差异,说明在进行蛋白翻译时细胞质中的EF1A含量显著高于细胞核中,这也为翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位提供了实验依据.     

水稻OsRRK1蛋白的进化分析及其亚细胞定位

水稻(Oryza sativa L.)OsRRK1(Rop-interacting receptor-like kinase 1)蛋白,属于类胞质受体激酶RLCK VI家族成员。通过将水稻的OsRRK1蛋白序列与小米、高粱、玉米、二穗短柄草、葡萄、苜蓿、大豆、棉花和拟南芥等9个物种的同源蛋白序列进行比对,发现OsRRK1蛋白与大多数植物的同源蛋白序列相似性都很高,特别是单子叶植物,相似性高达75%以上。依据NCBI公布的水稻OsRRK1的ORF(open reading frame)序列设计引物,从水稻籼稻品种Kasalath叶片cDNA中扩增得到目的片段,构建了OsRRK1:GFP融合瞬时表达载体,转化水稻原生质体对其进行亚细胞定位。激光共聚焦观察结果表明,水稻OsRRK1蛋白定位在细胞质中。     

马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位

为了研究马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位情况,采用RT-PCR技术克隆到马铃薯StHb1基因cDNA序列,并成功构建了StHb1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pBI121-StHb1-GFP.利用农杆菌介导法将重组载体转化洋葱内表皮细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白的瞬时表达以确定StHb1蛋白在细胞内的分布.结果表明StHb1蛋白主要分布于细胞核中.     

蜡梅热激蛋白基因 Cp HSP70-1的克隆、亚细胞定位与表达分析

在已构建的蜡梅花转录组数据库EST序列分析的基础上,采用 RACE技术克隆获得蜡梅热激蛋白 HSP70的cDNA序列,命名为CpHSP70‐1（GenBank登录号：KR071130）．该序列全长2520 bp ,包括1962 bp的完整开放阅读框,编码653个氨基酸蛋白序列,含有3个 HSP70家族典型基序．CpHS P70‐1蛋白与其他真核生物的HSP70蛋白具有较高的同源性,聚类分析显示其属于定位于细胞核／细胞质的蛋白．亚细胞定位结果支持该蛋白分布于细胞核的预测．利用实时荧光定量PCR对 CpHS P70‐1基因的表达特性进行分析,其在各组织中均有不同程度的表达,其中在成熟叶片中表达量最高;在不同花发育阶段呈现持续稳定的表达模式;该基因在低温和高温诱导下表达量提高,而且对高温的响应更为敏感．     

东南景天SaWRKY7基因对镉胁迫的响应研究

【目的】镉对植物具有高毒性,WRKY转录因子广泛参与植物逆境胁迫。研究镉诱导下WRKY基因的胁迫响应和抗性机制。【方法】以超积累型东南景天为试材,通过PCR克隆得到1个东南景天WRKY转录因子家族基因序列,结合生物信息学方法,分析其蛋白质结构和亲缘关系,构建GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白,观察其亚细胞定位,利用酵母验证其转录激活活性,通过qRT-PCR分析在镉胁迫下该基因的表达特性和组织特异性。【结果】获得了1条新的东南景天WRKY转录因子家族基因并命名为SaWRKY7,包含完整的开放阅读框,长度为1 011 bp,共编码336个氨基酸,为WRKY基因家族Ⅱd成员。SaWRKY7定位在细胞核,属于核蛋白,不具有转录自激活活性。SaWRKY7在东南景天的根、茎、叶中均有表达,且在根中相对有较高的表达量。与对照相比,在100 μmol/L CdCl₂处理0.5 h时,SaWRKY7在根茎叶中有较高的表达量,随后逐渐降低,属于早期诱导表达基因。【结论】SaWRKY7为WRKY转录因子家族成员,该基因定位在细胞核,不具有转录自激活活性,在早期响应镉胁迫诱导表达,推测其可能在东南景天镉积累或镉耐受过程中发挥重要作用。