斜带石斑鱼干扰素调节因子8基因的鉴定与表达模式分析

干扰素调节因子8(IRF8)是IRF家族转录因子中的一个成员.利用简并PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IRF8基因(EcIRF8)全长cDNA序列,其编码422个氨基酸残基的蛋白质,含有脊椎动物IRF家族的特征性结构域,即N端保守的DNA结合结构域(DBD)和C端多样化的干扰素调控因子结合结构域(IAD),其中DBD中包含5个特征性的色氨酸残基和1个核定位信号.与绝大多数脊椎动物的IRF8基因相似,EcIRF8基因组序列也是9个外显子和8个内含子的结构.EcIRF8在斜带石斑鱼肝脏中高水平表达.活体聚肌胞苷酸刺激后6h,EcIRF8在头肾、中肾、胸腺、肝脏和肠中的表达量显著上调(p0.05),其中在中肾中上调幅度最大,是对照组的106倍;副溶血弧菌(Vibrio paraheamolyticus)刺激后24h,EcIRF8在肝脏中的表达量也显著上调(p0.05),但上调倍数仅为对照组的9.37倍.结果表明,EcIRF8基因可能主要参与斜带石斑鱼的抗病毒免疫反应.     

日本鳗鲡γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)基因的克隆鉴定与表达分析

在日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得2个γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)基因AjGILT-1和AjGILT-2,并对其序列进行生物信息学分析,进而利用实时荧光定量PCR分别检测2个基因在不同组织器官中的表达水平,及其在脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表达变化.结果显示:2个基因编码的蛋白序列中均含有GILT家族的特征序列CQHGX2ECX2NX4C、活性位点CXXC、2个糖基化位点和11个保守的半胱氨酸残基,基因组序列均含7个外显子和6个内含子.2个基因启动子中都存在多个转录因子结合位点,如γ-干扰素活化位点以及特化蛋白1结合位点;不同的是AjGILT-1启动子区存在多个核因子-1、激活蛋白-1结合位点及干扰素刺激反应元件,而在AjGILT-2启动子区未发现.AjGILT-1在鳃和肠中表达量最高,而AjGILT-2在性腺、头肾和脾脏中表达量最高;除肠道外,同一组织中AjGILT-2的表达量均高于AjGILT-1.LPS、PolyI:C刺激和E.tarda感染后,AjGILT-1与AjGILT-2的表达在鳃中仅有少数变化,而在头肾和中肾中则变化较明显.综上所述,AjGILT-1和AjGILT-2基因可能参与了日本鳗鲡受病毒和细菌感染后的免疫应答.     

鳜IL-1β基因的克隆及原核表达

用RACE PCR获得了鳜白介素-1β(IL-1β)的全长cDNA.鳜IL-1β的cDNA全长为1298 nt(核苷酸),其5′非编码区包含UTR 93 nt;3′非编码区包含452 nt;其开放阅读框内包含753 nt,翻译成251个氨基酸.将鳜IL-1β克隆到原核表达载体pET-32a上,在大肠杆菌Rosettagami(DE3)内以包涵体形式得以高效表达.     

鳜干扰素刺激基因Viperin微卫星标记筛选及遗传变异分析

研究采用生物信息学技术在鳜干扰素刺激基因Viperin(Virus inhibitory protein, endoplasmic reticulum-associated, interferon-inducible)序列中发现了2个微卫星序列,通过设计2对微卫星引物,对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)、斑鳜(Siniperca scherzeri)和大眼鳜(Siniperca kneri)基因组进行PCR扩增分析其多态性.结果表明:Viperin基因微卫星多态性在3物种高低顺序依次为斑鳜,翘嘴鳜和大眼鳜,多态信息含量(PIC)在0.2394-0.8043之间,平均多态信息含量为0.5247,属于高度多态性位点.因此,本研究的2对引物可作为鳜3物种遗传分析的微卫星标记.     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸。其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS 具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸.其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

蓖麻PsbO基因的克隆与序列分析

用实验室栽培的蓖麻新鲜叶片为材料,Trizol法提取总RNA,参照GenBank公布的植物PsbO氨基酸序列,进行序列比对找出氨基酸序列保守区设计简并引物,通过RT-PCR扩增目的片段,纯化后克隆到T-Vector中测序,获得蓖麻的PsbO基因,对其基因序列进行分析。了解到其长度为1081bp,5＇非编码区为10bp,3＇非编码区为273bp,编码区长798bp,编码266个氨基酸。序列分析结果表明,蓖麻PsbO基因编码的氨基酸序列与已公布的其他植物中克隆到的PsbO氨基酸序列有较高的同源性。     

异源四倍体鲫鲤Sox9a基因保守区序列的克隆及内含子剪接位点分析

用特异于HMG-box保守区的兼并引物扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本(红鲫和鲤鱼)的Sox基因. 异源四倍体鲫鲤的扩增产物共有4条带,大小分别约为200,600,900和 1900?bp,而其原始亲本的扩增产物只有3条带,且在雌雄个体中未发现性别特异扩增带. 回收雄性四倍体鱼600?bp扩增带,经亚克隆及测序分析得到一个新的编码71个氨基酸残基的基因. 该基因与虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、蟾蜍(Xenopus laevis)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等的Sox9基因相似性达97%,据此命名为Atsox9a. 通过计算机分析和RT-PCR方法确定该基因含有内含子,并获得其内含子的序列和剪切位点,此内含子剪切位点在进化上是保守的. Atsox9a对于研究异源四倍体鲫鲤性别决定和分化机制及脊椎动物性别进化具有重要的理论意义.     

杂色鲍肌动蛋白启动子的克隆与序列分析

杂色鲍(H.diversicolor diuersicolor)是我国华南地区重要的海水养殖对象,作为利用转基因技术改良杂色鲍品质研究工作的首要部分,作者利用PCR和染色体步移(Genome Walking)方法克隆了杂色鲍肌动蛋白基因编码区部分序列和启动子序列(GenBank登陆号:EU622901).所分离的肌动蛋白基因DNA序列片段全长为1 990 bp,与GenBank中彩虹鲍(Haliotis iris)肌动蛋白A1基因序列和肌动蛋白A1a基因序列有非常高的相似性(99%和96%).在基因编码区中间发现了一个内含子区,在编码区之前发现一个类启动子区,经过Promoter Prediction在线软件分析,发现了该启动子序列和转录起始位点,同时也发现了该启动子特有的启动元件两个标准的CAAT BOX和一个TATA BOX.这些实验结果表明所克隆的杂色鲍肌动蛋白和启动子序列符合实验的目的.并且这一实验的成功也为下一步利用所分离的启动子做杂色鲍转基因工作打下基础.     

基于位置关联权重矩阵的大肠杆菌启动子预测

对实验证实的683条大肠杆菌sigma70启动子的序列进行保守性计算分析,获得四个保守的区域:-10区域是启动子最保守的功能元件,-35区域、转录起始位点附近及启动子上游UP单元.从保守区中选取M 6(1)值较大的10个保守位点的六联体频数作为参数、引入伪计数构建位置权重矩阵,利用位置关联打分函数对683条sigma70启动子进行预测.负集分别从编码区和非编码区选取700条序列进行算法检验,获得很好的结果,敏感性分别为91%和90%.进而利用位置关联打分函数对大肠杆菌整条序列进行搜索,获得1567条预测序列.这些序列可能是实验未测定的启动子序列.     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本Sox9基因HMG保守区内含子遗传变异性分析

参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列设计简并引物,扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫(Carassius carassiusred var.)和鲤鱼(Cyprinus carpioL.)的Sox基因.对不同片段大小的Sox基因测序,结果表明,四倍体鱼中存在两个Sox9基因(Atsox9a和Atsox9b),红鲫和鲤鱼中只发现一个Sox9基因(Rcsox9a和Ccsox9b).这4个Sox9基因在HMG盒中均含有内含子,大小分别为413bp,703bp,401bp和714bp,其插入位点遵守GT-AG法则.其中Atsox9a与Rcsox9a,Atsox9b与Ccsox9b的内含子序列都具有很高的一致性,分别为94.4%和97.8%,这表明内含子序列变异率较低.有趣的是,根据它们的外显子所推导的氨基酸序列一致性均为100%.因此,四倍体鱼及其原始亲本Sox9基因HMG基序内含子不仅具有长度多态性,而且内含子之间存在遗传变异性,这为进一步探讨异源四倍体鲫鲤的起源和进化提供了重要的分子生物学证据,同时也为正确掌握内含子的位置信息,功能和进化起源有着十分重要的作用.     

人IDE基因启动子生物信息学分析

对人IDE基因启动子进行生物信息学分析以获得人IDE基因启动子、CpG岛及转录因子结合位点特征.从UCSC基因组数据库成功获得人IDE基因5’调控区2 000 bp序列.Promoter 2.0、FPROM、NNPP预测人IDE基因分别有3个、2个、6个启动子.Relative profile score threshold选择80%、85%、90%、95%、100%时,JASPAR预测该序列存在5170、1771、454、87和5个可能的转录因子结合位点.Relative profile score threshold选择80%,搜索到6个潜在的TCF7L2转录因子结合位点.采用进化足迹法,LAGAN预测方法获得位于人和小鼠同源IDE基因启动子保守区域相同位置的转录因子结合位点为14个,包含转录因子SPI-1、cap、c-FOS、FREAC-3、c-ETS、Cdxa、HSF2等.发现一个CpG岛,位于1 303～1 705 bp 之间,大小为403 bp.人IDE基因启动子、CpG岛及转录因子结合位点的生物学信息学分析,为下一步基因表达调控实验奠定了基础.     

乌鳢β-肌动蛋白cDNA克隆与表达分析

利用RT-PCR技术首次克隆获得了乌鳢(Channa argus)的β-肌动蛋白基因cDNA序列.结果显示,乌鳢β-肌动蛋白的cDNA序列全长1 813bp,包含一个1 125bp的开放阅读框(ORF),共编码375个氨基酸.蛋白序列分析显示,乌鳢β-肌动蛋白的相对分子质量为41.731kDa,等电点PI为5.16,由20种氨基酸组成(甘氨酸数目占比最高为7.73%,色氨酸数目占比最低为1.07%),含有3个actin信号位点.蛋白同源性分析显示,乌鳢β-肌动蛋白与大西洋鲑、虹鳟、莫桑比克罗非鱼的同源性达99%以上,与非洲爪蟾、鸡和人等脊椎动物的同源性达98%以上,表明β-肌动蛋白基因在不同物种之间具有很高的保守性.基于NJ法的β-actin基因系统发育分析显示,乌鳢处于鲈形目和鲑形目鱼类的基部,并没有与鲈形目鱼类聚类为一支,表明乌鳢β-actin基因的进化速率较其他鲈形目鱼类更慢.组织表达分析显示,乌鳢β-actin在检测的11个组织中均有表达,且表达量比较稳定,表明该基因可作为内参选择时的候选基因,可为乌鳢功能基因研究时的内参选择提供参考.     

脂肪酶基因结构和氨基酸序列的比较

采用PCGENE6 8软件系统对真菌脂肪酶基因和氨基酸序列进行了分析。真核生物中多数结构基因中含有内含子 ,但真菌脂肪酶基因几乎有一大半的是连续的 ;对于有内含子的基因 ,不同脂肪酶基因所含内含子数目各异。所有脂肪酶一级结构中都包含Gly X1 Ser X2 Gly保守序列 ,在真菌脂肪酶中该序列更保守 ;Ser、Asp/Glu和His3个氨基酸残基组成了真菌脂肪酶的活性中心 ;大多数真菌脂肪酶是糖蛋白 ,但也有一些不含糖基的脂肪酶 ,主要取决于脂肪酶一级结构中是否存在糖基化识别序列。     

白菜防御素基因的预测及结构功能分析

采用生物信息学的方法,通过已知防御素基因家族基因氨基酸序列在线Blast相似性比对,对白菜(Brassicarapa)基因组中防御素基因进行了预测和鉴定,分析了防御素基因在进化过程中各部分结构,包括上游区域、启动子区域、外显子区域、内含子区域以及UTR区域的结构变异以及功能变异,对该基因上游序列顺式作用元件和表达模式进行了预测。分析结果表明,白菜防御素基因编码60～80个氨基酸短肽,编码氨基酸均具有8个保守的半胱氨酸;白菜防御素基因功能结构域保持相对稳定,但部分基因成员前端信号肽序列出现变异;内含子长度出现增长、缩短、消失等3种变异模式;该基因上游启动子区域核苷酸变异较其他区域显著,上游序列顺式作用元件大多与光应答、逆境胁迫应答和信号分子应答相关。该基因表达模式预测结果表明白菜防御素基因在进化过程中可能出现分化,主要体现在基因沉默和表达部位的差异。     

人类Batten病基因CLN3及其突变的生物信息学分析

利用生物信息学方法对与儿童蜡样质脂褐质沉积症(NCLs)相关基因CLN3的结构进行了深入的分析.根据CLN3的Mrna序列对其进行了染色体精确定位,确定CLN3的ORF及其外显子的位置;分析CLN3蛋白质(CLN 3P)结构特点和修饰位点,并明确近缘种及远缘种的保守区域和突变致病的关系.结果表明,CLN3位于人类16号染色体的短臂(16(p12.1～p11.2));基因全长为14804bp,包含15个外显子和14个内含子,ORF长度1317bp,编码438个氨基酸.蛋白质功能域分析表明,CLN 3P是一种分子量为43kDa的高度糖基化的溶酶体膜蛋白,该蛋白存在酰基化、糖基化和多种磷酸化修饰位点,在近缘的CLN 3P中存在高度保守的区域,进一步对10个远缘蛋白的多序列进行比对,发现了该蛋白质中最为保守的区域;45种CLN 3P的突变分析显示,主要的突变位于101、161～162、170、187、199、211、295、327、330、334、352等12个氨基酸位点,这些突变几乎发生在保守区域,突变还表现出一定的分布特点及地区差异,说明保守序列的突变是该疾病产生的重要原因,为该病的分子诊断提供了依据.     

蛋白酶结构基因及其克隆

为探明重要毒力因子玫烟色棒束孢几丁质酶基因Ifupr1的表达调控机理,以Ifupr1基因组全长核苷酸序列为基础,采用基因组步移方法,获得Ifupr1的5′-上游区序列(总长为2402bp)。分析其结构基因中无内含子,该序列含有启动子的核心结构序列CAAT框、特异的反应元件和转录因子结合位点。CAAT框是调控转录速率的元件,而其他一些转录因子结合位点则可能具有特异性调节基因转录的功能。