A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因遗传进化分析

对疑似感染FMDV的样本进行了FMDV VP1基因RT-PCR鉴定,测定了其中1个阳性样本序列(命名为HY).采用生物信息学软件比较了HY与参考序列的同源性,并构建VP1基因的分子系统树.结果表明:HY属A型FMDV亚洲拓扑型东南亚-97谱系,与我国近年来报道的A/GDMM/CHA/2013的序列相似性为99.1%,与AF/72疫苗株的相似性仅为79.0%.提示我国近年来报道的A型毒株与AF/72疫苗株的序列差异较大,应及时更换A型口蹄疫疫苗毒株.     

轮状病毒VP7基因的克隆及核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了916bp的VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-V7中含有轮状病毒的VP7基因片段。经核苷酸序列分析，表明正确克服了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区。     

O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.     

犬细小病毒CPV-SHZ分离株VP2基因的克隆与序列分析

以本实验室分离鉴定犬细小病毒新疆石河子株（CPV-SHZ）的DNA为模板,根据基因库已发表CPV序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,进行聚合酶链式反应,扩增出约1.7kb的片段,按常规方法克隆进pMD18-T载体,经EcoR I和Sal I双酶切筛选到阳性质粒。测序得到VP2全基因组序列,并登陆Genbank（EU170352）。进一步对该片段进行序列分析,结果表明：所扩增基因片段长度为1755bp,与CPV参考株毒株V154（Type2a）、LCPV-V204（Type2b）、LCPV-V139（Type 2c（a））、LCPV-V203（Type 2c（a））,其核苷酸的同源性分别为99.32%、98.75%、98.97%、98.69%,确定CPV-SHZ株基因型为2a型,将其同我国和世界其他国家主要分离株进行基因系统发生进化关系分析,结果表明,其与我国北京分离株BJ018/07亲缘关系较近。     

O型口蹄疫病毒VP1基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

旨在构建能够表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的重组山羊痘病毒(GPV),并以此为活载体疫苗,评估其免疫效力.将FMDV的VP1基因插入转移质粒pTKfpgigp中,构建重组转移质粒pTKfpgigp-VP1,并转染已感染GPV的羔羊睾丸(LT)细胞,产生重组GPV(rGPV),筛选纯化rGPV,检测rGPV在LT细胞中VP1基因的表达情况.将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘(GP)和口蹄疫(FMD)特异性抗体水平.结果表明,获得含有FMDV的VP1基因重组毒株rGPV/FMDVVP1,在LT细胞中VP1基因进行正常转录,其表达产物能与FMDV抗血清产生特异性反应.rGPV能诱导产生不同水平的抗GP和FMD的特异性抗体.可为FMD重组标记疫苗的研制提供参考.     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV—NM)提取总RNA，经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段，并构建至pGEM—T载体中。序列测定后，将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析：同源性为40％。通过PCR法标记克隆的cDNA片段，制备地高辛标记探针，与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交，并作敏感性试验，结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性，可检测出50pg的病毒RNA。     

马铃薯卷叶病毒中国分离株外壳蛋白基因及其上游先导序列的cDNA克隆和序列分析

按照马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）核苷酸序列，针对ＣＰ基因及其上游基因间隔区全长约０．８ｋｂ的区段设计合成两个特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成ＣＤＮＡ第一条链，再经ＰＣＲ扩增合成ｃＤＮＡ，将ＣＤＮＡ克隆于ｐＵＣ１９质粒．限制性酶切分析和核苷酸序列测定表明克隆的ＰＬＲＶ－Ｃｈ外壳蛋白（ＣＰ）基因及其上游基因间隔区的全长ＣＤＮＡ共８２４个核苷酸，与国外报道的４个ＰＬＲＶ分离株的核苷梳序列相比具有高度同源性．ＰＬＲＶ的外壳蛋白基因序列与其上游基因间隔区相比保守性更强．     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5''端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northern blot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50 pg的病毒RNA.     

昆明地区1株HAM野毒株的基因分型

免疫捕获粪便悬液中的HAV，RT－PCR扩增目的的片段，将其连接到载体pUC18中，测序并对序列进行分析和比较，HAV野毒株W在核苷酸3024－3191与HM175/wt序列相同，表明W株为ⅠB亚型；该株5'NTR的核苷酸29－258与其它国际毒株有很大的不同，有碱基的、缺失和插入，其中插入的15个碱基是其它毒株所没有的。     

新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因的序列分析

研究分析了新城疫病毒中国标准强毒Ｆ４８Ｅ８株核衣壳蛋白基因的序列,该基因的编码区长１４６７个碱基对,编码４８９个氨基酸,Ｆ４８Ｅ８株与弱毒株Ｄ２６株相比,核衣壳蛋白 的氨基酸同源性为９４．１％。     

猪口蹄疫病毒基因工程疫苗的工程菌的发酵研究

在猪口蹄疫病毒活性肽ＶＰ１融合蛋白基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＣ５００构建成功的基础上，研究了Ｃ５００的质粒稳定性，Ｃ５００在４种不同培养基中的生长曲线，以及不同种龄，接种量，装液量，碳源氮源对菌体生长的影响。     

猪口蹄病毒VP1活性肽融合蛋自的纯化

在猪口蹄疫病毒（FMDV）活性肽VP1融合蛋白基因工程菌E．coliC500构建成功的基础上,确定了融合蛋白的分子质量约为71．0ku．对于融合蛋白的提纯,确定了超声波破壁,尿素分级纯化,葡聚糖G－100柱层析,DEAE纤维素DE－52柱层析的方法,将目的蛋白提纯了6．75倍,SDS－PAGE呈一条带．并比较了融合蛋白的半乳糖苷酶反应（ONPG）和酶的温度敏感性等性质的变化．     

苜蓿花叶病毒复制酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV—Ch)RNA2为模板，利用人工合成的特异性引物，进行反转录及PCR扩增，分两段分别扩增了复制酶基因的5′端1．32kb和3′端及其非编码区的1．23kb cDNA序列．用限制性内切酶切割PCR产物后，与pUCl9重组，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒，用限制性内切酶分析及PCR鉴定，得到分别含有5′端序列和3′端序列的重组质粒。已由上述两种重组质粒构建了含有完整复制酶基因的重组质粒．进行了全序列测定，并与国外报道的A1MV-425株系的相应序列相比较，其复制酶基因编码区核苷酸序列同源性达97．8％，推测的氨基酸序列的同源性达97．6％，3′端非编码区核苷酸序列同源性为98．2％．并将全长复制酶基因与植物表达载体pROKⅡ重组，得植物转化载体pAlMV—FL．     

啤酒花潜隐病毒新疆分离物的全基因组序列分析

对新疆啤酒花上获得的HpLV分离物HpLV-XJ进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示:HpLV-XJ的全基因组序列为8612个核苷酸(nt)(不包括poly A),含有6个开放阅读框(ORF),分别编码224 kDa(ORF1)、25kDa(ORF2)、11 kDa(ORF3)、7 kDa(ORF4)、34 kDa(ORF5)、和12 kDa(ORF6)蛋白。序列相似性分析结果表明,HpLV-XJ与HpLV(GenBank:AB032469)序列相似性达98.5%,6个开放阅读框的核苷酸序列相似性分别为98.3%、99.0%、97.6%、96.7%、99.5%和98.4%;由此推导的氨基酸序列相似性分别为98.6%、98.7%、97.2%、95.0%、99.4%和98.1%,各个基因的核苷酸序列和蛋白的氨基酸之间存在着一定的差异。     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因3′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板，经反转录PCR扩增，将获得的ORF2a的3′端1kb cDNA克隆于pUCl9中，构建成重组质粒pLR7，经PCR检测、酶切检测，表明获得了ORF2a的3′端1kb cDNA克隆．从两端进行了两次序列分析，将获得的核苷酸序列与国外报道的四个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较．结果表明它们具有高度同源性．文中对核苷酸中存在的可能移码序列及其下游的茎环结构(或假节结构)，以及上游特征性三次重复序列进行了分析和讨论，发现上游特征性三次重复序列连续排列可形成几个连续的互补双链区和发夹结构，这一结构可能与移码有关．     

口蹄疫病毒抗原表位的编码序列在大肠杆菌中表达

为在大肠杆菌和牛分枝杆菌 BCG中表达口蹄疫病毒 ( Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV) O、A、C三种血清型抗原表位的编码序列 ,我们优化筛选了这三种血清型主要抗原表位的序列 ,设计合成了其编码 DNA序列 ,并将此序列克隆到细菌表达载体 p QE4 1中 ,转化大肠杆菌 M1 5 [p REP4 ],经 IPTG诱导 ,在 SDS-PAGE中得到 34 k D的小鼠二氢叶酸还原酶( DHFR)基因与 FMDV的三型抗原表位编码序列的融合表达的蛋白质带 .     

登革病毒GD01/98结构蛋白基因序列及蛋白二级结构初步分析

对登革病毒GD0 1 98结构蛋白基因采用RT -PCR、分子克隆等方法进行测序 ,获得了分离株的结构蛋白基因核苷酸序列 2 419bp ;并通过Internet、用Blast等软件进行同源性分析 ,发现它同泰国分离株最近 ,可能来源于泰国 ;根据核苷酸序列 ,推导蛋白一级结构 ,并用GOR、神经网络 (HierarchicalNeuralNetwork)等方法进行二级结构预测 ,发现有 46 74%氨基酸参与无规卷曲 ,有 31 16 %氨基酸参与α -螺旋 ,没有 β折叠     

Complete Nucleotide Sequence of a Newly Avirulent Newcastle Disease Virus Hubei 92(HB92) Strain

Newcastledisease (ND )isaseriousaviandiseasewithworldwidedistributionthatcancausesevereeconomicloss esinthepoultryindustry .Thecausativeagentofthedisease ,newcastlediseasevirus(NDV)alsoknownasavianParamyxovirustype 1,isamemberoftheParamyxoviridaeandcontainsasin gle strandednegativesenseRNAgenomeencompassing 15 186nucleotides[1 3] .Theviralgenomecontainssixgenes ,whichen codetheviralnucleoprotein(NP) ,phosphoprotein(P) ,matrixprotein(M ) ,fusionprotein (F) ,hemagglutinin neuraminidase(HN…     

日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1 E基因的5'端克隆及部分序列分析

根据国外报道的JEV(Japanese encephalitis virus)基因组全序列,针对JEV E基因5'端设计合成一对特异引物,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA 为模板,经RT-PCR扩增,获得366 bp的JEV E基因cDNA片段.将此片段重组于质粒pUC 19中,并转化大肠杆菌DH5α.经PCR扩增,酶切及序列分析,结果表明JEV M73-1 5'端126个核苷酸序列与JEV日本Nakayama株和JaOArS 982株的同源性分别为96.8%和96.8%,氨基酸序列同源性均为99.2%.通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了1973年在呼和浩特市流行的脑炎是由JEV引起的流乙脑炎.E基因编码JEV的囊膜糖蛋白,是其重要表面抗原.JEV M73-1 E基因5′端克隆和部分序列分析对JEV的分子生物学研究、建立分子生物学诊断技术以及基因工程疫苗的研制均具有重要学术意义和实际价值.