人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达

利用人骨形成蛋白-4(hBMP4)与人骨形成蛋白-7(hBMP7)的成熟肽cDNA片段制备转基因毕赤酵母菌株,实现了hBMP4与hBMP7在巴斯德毕赤酵母细胞中的共表达.Western-blotting分析表明,表达产物含有hBMP4与hBMP7,片段大小分别为26 kD和17 kD,均为单体蛋白.     

重组人骨形态发生蛋白4在毕赤酵母中的表达研究

试图建立人骨形态发生蛋白-4在毕赤酵母(Pichia pastoris) 中的表达技术.包括:将hBMP4成熟片段从全长cDNA亚克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达rhBMP4的载体质粒pPIC9K-hBmp4.经转化Pichia pastoris宿主菌株GS115,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达上清液经SDS-PAGE和Western-blot 分析,结果表明rhBMP4以单体形式分泌到发酵上清液中,单体分子质量大小约为26 ku,摇瓶表达量达到20.13 μg/mL.     

酵母Yarrowia lipolytica的密码子用法分析

分析了酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ的４３个蛋白编码基因的同义密码子使用情况。计算了酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ的密友子地;首镒确定出了母Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｉｃａ的１７个视表达优越密码子。这些结果与已知的酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中的密码子用法存在较大的差别,说明Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ有特有的密码子用法。     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.     

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

肿瘤抑制因子p53蛋白在毕赤酵母中的克隆表达

TP53基因在调控细胞信号通路和抑制肿瘤细胞中发挥着重要作用.本研究利用毕赤酵母表达系统以获得大量重组p53蛋白,为此,本文将人TP53基因克隆至表达载体p PIC3.5K,电转化进入毕赤酵母GS115,通过组氨酸筛选和G418筛选,获得高拷贝稳定转化子.SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明p53蛋白可以在毕赤酵母中表达.本研究所获酵母菌株为今后大规模生产重组p53蛋白奠定了基础.     

重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制

在利用转基因毕赤酵母发酵表达重组人血清白蛋白时,遇到了较为严重的蛋白降解;为了抑制蛋白的降解,分别研究了温度、pH值和氮源的加入对降解的影响。结果表明,pH值和氮源的加入对白蛋白的降解控制有显著的正面影响,而温度的变化对降解的影响不大。当控制pH为7.0,添加酵母提取物和蛋白胨体积分数分别为0.5%和1%时,白蛋白的降解得到了有效的控制,可得到质量分数为58%的完整白蛋白。     

朱黄青霉α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达

【目的】提高朱黄青霉（Penicillium minioluteum ）α-葡聚糖酶（Dextranase）基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达水平。【方法】根据毕赤酵母的密码子偏爱对酶基因进行优化与合成。优化后的基因片段与载体 pGAPZαA 连接,转化毕赤酵母 KM71 H。【结果】获得组成型分泌表达α-葡聚糖酶的工程菌 KM71 H／pGAPZαA-dex。发酵工艺试验中,摇瓶培养144 h,酶活为153 U／mL。6．8 L发酵罐补料分批培养92 h,酶活达到1218 U／mL。【结论】该工程菌以甘油作为碳源,发酵调控简单,产酶水平较高,具有适用于大规模生产的潜力。     

毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白的研究

本试验将能够成功表达重组人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后，流加亚硒酸钠，同时设空白对照发酵液(不加入亚硒酸钠)，通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量，判断硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重组蛋白质中。发酵液经热处理、超滤、离子交换和丙酮沉淀等步骤后，进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、X射线能量色散谱(EDX)和原子吸收分析。结果表明，加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2%，硒与蛋白质的质量比为0.0069，高于对照发酵液近35倍，初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化，转化为硒代氨基酸，并形成硒代重组蛋白质。     

重组骨形成蛋白—2与珊瑚人工骨复合物应用于拔牙窝修复的动物实验研究

目的：探讨重组骨形成蛋白－2（recombinant human bone morphogenetic protein rhBMP-2)/珊瑚人工骨复合物（复合骨）与珊瑚人工骨（珊瑚骨）在拔牙窝修复中的作用,方法：12只成年狗作为实验动物,拔除两侧上颌 第2及第3切牙,并去除牙槽窝之间的牙槽间 ,一侧随即植入复合骨,对侧植入珊瑚内作为对照,于并植骨后4,8,。12周取材,采用组织学观察及计算机图像分析方法,观察比较两种植入材料在拔牙窝内的骨修复能力及修复效果,结果：复合骨具有较强的骨修复作用,植入牙槽窝后,材料被逐渐降解吸收,新骨不断形成,12周后,植入材料完全被成熟的骨组织取代,图像分析结果显示复合骨组新生骨形成的比值明显高于珊瑚骨组,两组比较均有显著性差异（P＜0．05）,结论：复合骨在拔牙窝中的骨修复能力和修复效果明显优于珊瑚骨。     

可降解Hr-BMP复合胶原膜修复腭部骨缺损的实验研究

目的：观察腭部扁平骨引导性骨再生现象（GBR），探讨利用GBR修复腭裂骨缺损的可能性。方法：建立幼犬腭部骨缺损实验动物模型，应用常规组织学检查术、免疫荧光显微法、X线及扫描电子显微术在实验过程的不同阶段进行观察研究。结果：1）借助复合人重组骨形成蛋白（Hr-BMP）胶原膜GBR，腭部骨缺损可以完全修复；2）胶原膜可提供成骨所需的密闭空间；3）复合Hr-BMP胶原膜具有良好的组织相容性和安全性；4）复合Hr-BMP胶原膜GBR所致骨形成的量及速度均高于其它对照。结论：1）复合Hr-BMP胶原GBR具有确实有效的骨引导和骨诱导性，在骨缺损修复的早期阶段即可产生大量的新骨；2）复合Hr-BMP胶原膜植入后4周内的成骨活动最活跃，胶原膜和复合Hr-BMP胶原膜在其降解吸收过程中，不干扰后续的成骨活动；3）仍有必要构建具有适合的吸收降 解性和一定力学强度的隔膜材料。     

表达胰岛素的毕赤酵母生长动力学及诱导策略

对本实验室构建的一株重组巴斯德毕赤酵母基因工程菌的生长及诱导进行了研究,结果表明生长阶段菌体的生长与限制性基质甘油残留浓度的关系符合Monod关系式,细胞最大生长比速率为0.204h^-1,饱和常数为24.3g/L。经参数推导得理论最大细胞对甘油得率为0.497g/g,以及菌体生长维持系数为0.007g/g·h,后者说明此株工程菌有高密度发酵的潜力。诱导阶段补加酵母提取物、大豆蛋白胨和微量元素能有效提高目的蛋白产量。在发酵罐上罐试验中,目的蛋白产量达256mg/L,蛋白产量是摇瓶发酵蛋白产量的5倍多。     

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHCMVp的研究

目的：提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法：将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS—PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果：摇瓶培养时,转化子在体积分数1％的甲醇pH6．0的条件下诱导72h,A600(菌体密度)为45．2,目的蛋白表达量达到10．2mg／L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1％甲醇诱导48h,最终A600(菌体密度)达到124,每升发酵液中含目的蛋白57．21mg。结论：通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

重组人骨形态发生蛋白诱导异位成骨的病理学观察

目的：本文报告了重组人骨形态发生蛋白－２在小鼠肌肉内诱导异位成骨的生物学作用。结果：植入重组人骨形态发生蛋白－２后１天有间充质细胞向植入区内聚集;５天出现典型的软骨细胞;７天钙化开始;１０天形成雏形的骨髓腔;１４天骨髓腔内出现幼稚的造血细胞;２１￣３０天形成大量网状骨小梁、骨单位,在骨小梁间隙出现骨髓细胞。结论：大肠杆菌表达的重组人骨形态发生蛋白－２具有较强的诱导成骨活性。