心室肌细胞L型钙离子通道研究

L型钙通道电流是心肌细胞动作电位的重要组成部分，亦是细胞内钙释放的重要触发因素。通过研究分析表明，氧反常早期L型钙通道功能异常是导致细胞内钙超载的重要启动因素，而L型钙通道功能异常是诱发折返性心律失常的重要机制。     

氯离子通道膜蛋白内部离子输运的动力学模拟

为了方便、直观地研究氯离子通道膜蛋白内部氯离子输运过程的动力学性质,利用全原子分子动力学模拟方法对大肠杆菌氯离子通道膜蛋白的蛋白质-膜-水溶液系统进行能量最小化和平衡模拟,并对氯离子在通道中输运过程的受力进行拉伸分子动力学模拟计算。结果表明：平衡模拟约40 ns后,膜蛋白结构逐步达到热力学平衡态;通道内部中间结合位点氯离子与周围氨基酸相互作用最强,稳定性最好;氯离子输运过程中主要受到通道尺寸影响,通道宽处受力小,通道窄处受力大,其中靠近外部结合位点处通道最窄,氯离子所受拉力最大,约为300 pN。     

过量运动对大鼠心肌细胞钙离子通道的影响

研究过量运动对心室肌细胞钙离子通道的影响,旨在进一步探讨其在心肌损伤中的意义。制备离体心室肌细胞并用去甲肾上腺素（NE）诱导建立类似过量运动所产生的应激心肌细胞模型,应用流式细胞术（FCM）和Fura2荧光分光光度法测定应激心室肌细胞的凋亡率和心肌细胞内游离钙浓度变化。实验组心肌细胞异常活动可能导致钙超载,从而引起心肌细胞凋亡,导致应缴性心肌损伤的发生。     

钙释放激活钙离子通道的发现及研究现状

Ca2+释放激活Ca2+(CRAC)通道是位于非兴奋性细胞质膜上的慢Ca2+通道,是非兴奋性细胞(尤其T淋巴细胞和HEK 293细胞)中胞外Ca2+进入细胞内的主要途径.Ca2+内流是T淋巴细胞激活的最重要的生理生化特征之一.Orai1蛋白单体是组成CRAC通道的亚基,4个Orai1蛋白亚基构成一个四聚体CRAC通道.内质网Ca2+浓度的降低使得STIM1发生定向运动并产生聚集,从而激活了CRAC通道.STIM1蛋白把内质网Ca2+的损耗与CRAC通道上的Ca2+内流联系起来,行使了Ca2+浓度感受器的功能.     

Xyloketals的分子结构与其抑制钙离子通道活性的理论研究

 采用量子化学半经验方法PM3对结构新颖的活性化合物xyloketals进行了几何构型优化。根据计算结果分析了xyloketals的分子结构与抑制钙离子通道活性的构效关系,结果表明xyloketals抑制钙离子通道与分子的体积、疏水参数和前线分子轨道的能量等显著相关。     

酵母表达系统表达外源基因的研究进展

阐述了几种常用的酵母表达系统的研究现状及应用前景,并对酵母分泌的外源蛋白的含量及糖基化程度进行了比较．我们认为：甲醇营养型酵母分泌的外源蛋白量高且无过度糖基化现象,具有良好的应用前景     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris,P .pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统 ,该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点 ,而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。该研究对巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作了简要的综述     

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化

以高效原核表达载体pCold TF为载体骨架,应用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法,将pCold TF中的六聚组氨酸(His-Tag)序列替换为限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT,构建不含His-Tag序列的新载体pL118.以此载体表达蛋白时,通过PCR引物在目的基因3′端添加His-Tag以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Trigger Fac-tor(TF)助溶蛋白的去除.应用pL118对人膜蛋白CD81进行原核表达与纯化,并使用Fac-tor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白,获得3′端含有His-Tag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化,为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81的功能奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.     

拟南芥膜蛋白GPX3的原核表达及纯化

本文从哥伦比亚生态型的拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia 0)中克隆了谷胱甘肽过氧化物酶AtGPX3的完整编码序列(Coding sequence,CDS)以及部分片段的CDS序列,构建了该基因的不同区域的表达载体,在Transetta(DE3)的BL21大肠杆菌中表达,并成功纯化了GPX3膜蛋白,不仅为后续实验研究GPX3的结构与功能提供了材料,而且为研究膜蛋白表达与纯化的方法提供了借鉴.     

钙离子敏感受体在大鼠子宫中的表达

本实验为了探讨钙离子敏感受体(Calcium-sensing receptor,CaR)与胚胎着床及蜕膜化的关系,建立了大鼠早期妊娠、假孕、延迟着床和人工诱导蜕膜化模型,收集各种模型的子宫材料,利用免疫组化方法检测了CaR在大鼠子宫中的表达。结果表明,CaR在妊娠第6~9天的子宫蜕膜上强表达;假孕第6~9天和延迟着床的大鼠子宫腔上皮下基质中无明显的免疫信号,而延迟着床激活胚胎周围的腔上皮下基质中有强的免疫信号。蜕膜化子宫中整个蜕膜区呈强的免疫染色信号。从而推断,CaR蛋白的表达与胚胎着床及蜕膜化过程密切相关。     

毕赤酵母表达猪胃蛋白酶的研究

利用已有的猪胃蛋白酶原A cDNA,构建毕赤酵母pPIC3．5K—pA胞内表达载体．经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得2株高表达的重组子,并研究了在不同pH、不同诱导时间、不同起始浓度和甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低．结果表明：在pH7、诱导72h、起始诱导浓度为OD600为2、甲醇诱导浓度为1％时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6．46U／mL．     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

兔防御素基因酵母表达的研究

防御素是由动植物体内产生的一种多肽类抗菌、抗病毒活性物质,本研究根据巴斯德毕赤 酵母偏爱密码子的特性,设计兔防御素NP2基因,并构建巴斯德毕赤酵母的表达质粒pGAPZα-NP2,通 过LiCl法转入巴斯德毕赤酵母中,筛选和检测结果表明,兔防御素NP2基因已经成功地转入巴斯德毕 赤酵母,并得到表达。该实验可为兔防御素NP2抗菌抗病毒的研究和开发奠定理论和物质基础。     

法夫酵母整合型表达载体的构建

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明:法夫酵母对20μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.     

毕赤酵母表达系统的实际应用研究

在DNA体外重组和异源表达技术中,酵母表达系统是重要的一个组成部分。对于它的优势,大量中外文献用实例证明,用综述总结。酵母菌是最简单的真核模式生物,兼有原核、真核两种表达系     

Neuritin毕赤酵母分泌表达系统的构建

为构建Neuritin毕赤酵母分泌表达系统,进一步得到高纯度的具有天然活性的Neuritin蛋白提供实验基础。采用人工合成去除信号肽的neuritin基因并在N端引入His标签序列,两端引入Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,克隆至p PIC9K分泌型表达载体。重组质粒经PCR与测序鉴定正确后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,经MD平板与G418平板筛选阳性重组子,抽提毕赤酵母基因组PCR鉴定重组质粒的插入。结果显示,p PIC9K-neuritin重组质粒经测序鉴定完全正确,电转后成功插入毕赤酵母基因组中。由此可知,成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

基于S2细胞建立钙库调控钙离子通道特异分子的筛选模型

应用Flexstation胞质溶胶钙离子检测技术,研究利用果蝇S2细胞建立钙库调控钙离子通道SOC的特异分子的筛选模型.通过三种已知钙通道拮抗剂的检测,发现培养温度为24℃,细胞密度为2×106个/mL时,利用终浓度为2μmol/L的SOC通道激动剂TG可建立稳定的细胞筛选模型.     

血小板生成素在毕赤酵母中的表达

以人胎肝cDNA文库为模板,用PCR和DNA重组技术,将TPOcDNA克隆到pGEM     

Monellin基因在酵母中的表达研究

本实验根据毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9KM,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Westerm blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白比同等重量的蔗糖甜约1000倍.     

类人胶原蛋白表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

基于人胶原蛋白胶原域序列特征,设计合成了一段类人胶原蛋白基因单体gel.采用同向串联方式,构建了含6个单体的类人胶原蛋白表达载体pPIC9KG6,并经DNA测序鉴定.将pPIC9KG6电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)经G418筛选得到多拷贝转化子,通过甲醇诱导表达类人胶原蛋白,SDS-PAGE检测表明:初步表达的类人胶原蛋白为胞外产物,其表观分子量为112 ku.