中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系(引物为中国鲎微卫星引物).并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系:总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件:模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

山药基因组DNA的提取和RAPD反应条件的优化

研究了山药基因组DNA的提取方法;对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,建立了最佳的RAPD反应体系:在25μL反应体系中Mg2+浓度为2.0 mmol.L-1,dNTPs浓度为0.25 mmol.L-1,引物浓度为20 pmol.L-1,Taq酶1.5 U,模板DNA为200 ng.扩增程序为:95℃预变性7 min;94℃变性30 s,36℃退火45 s,72℃延伸2 min,共35个循环;72℃终延伸10 min.     

均匀设计优化黑木相思ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响黑木相思ISSR-PCR体系的引物、Mg2 、dNTP、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行5因素5水平和5因素3水平两轮优化,建立了适合于黑木相思ISSR-PCR的体系:在20μL反应体系中,含引物0.30μmol.L-1,Mg2 3.00 mmol.L-1,dNTP 0.15 mmol.L-1,Taq DNA聚合酶0.75U,模板DNA 2.00 ng.μL-1.在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度、退火时间进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性5 min;接着进行33个循环:94℃变性35 s,52~61.5℃退火52 s,72℃延伸90 s;循环结束后,72℃延伸10 min.同时筛选得到10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.     

粗壮女贞RAPD-PCR实验体系优化的研究

以粗壮女贞嫩芽为材料,对粗壮女贞RAPD分析中一些重要影响因素,包括模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2 浓度、Taq酶用量、退火温度、延伸时间以及循环次数等因子进行了比较系统的摸索和优化.建立了适合粗壮女贞RAP-PCRD分析的优化反应体系:即25μl 反应体系中Mg2 浓度为2.5mM,dNTPs浓度为200μM,Taq酶用量为2.0U,引物浓度为10pmol,模板浓度为80ng.PCR扩增程序为:94℃预变性4min,然后按94℃变性30s,37℃退火45s,72℃延伸120s,进行40个循环,最后于72℃延伸10min.以该优化的RAPD条件进行重复实验,其实验结果重现性良好.     

海南普通野生稻ISSR-PCR反应体系的优化

通过不同浓度的Mg2+、模板DNA、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度和循环次数的单因素试验,筛选海南普通野生稻最佳ISSR-PCR反应体系为:15μl反应体系中含2.0 mmol/L MgCl2,50 ng模板DNA,200μmol/L dNTPs,1.20 U Taq酶,1.5μmol/L ISSR引物,50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3).反应程序:94℃预变性5 min;94℃,1 min,52℃,1 min,72℃,2 min,35个循环;72℃延伸10min,4℃保存.     

蚕豆SSR-PCR体系建立及优化

为了建立适宜蚕豆的SSR-PCR反应体系,用于蚕豆的SSR分子标记研究。以青海12号、透心绿为材料,通过正交设计L16(45)对蚕豆SSR-PCR反应体系中的Taq酶,Mg~(2+),dNTPs,引物和模板DNA 5个因素的4个水平进行优化试验。结果表明:各因素不同水平对PCR反应均有影响,各因素对PCR扩增结果的影响大小分别为:Taq酶dNTPs模板DNA引物Mg2+。最终筛选出蚕豆最佳SSR-PCR反应体系(20μL):1U Taq酶,0.75 mmol/L d NTPs,100 ng模板DNA,2μmol/L引物和1.5 mmol/L Mg~(2+)。     

大白菜RAPD扩增体系的优化研究

以大白菜3411－7自交系为材料，使用PE公司生产的Thermal Cycler480型PCR仪，对影响大白菜RAPD扩增的因素进行了研究，确定了模板，Mg^2 ,dNTPs，引物和Taq DNA聚合酶的适宜浓度和最佳的循环次数。实验结果表明，在25μL反应体系中使用20－60mg的模板DNA，1.5-2.0mmol/L的Mg^2 ,0.15-0.25mmol/L dNTPs,0.8-1.0μmol/L随机引物，1.0-1.5U Taq DNA聚合酶，在94℃下预变性5min后执行94℃ 1min,37℃ 1min,72℃ 2min，35个循环，最后72℃再延伸5min的条件下，大白菜的RAPD扩增效果较好。     

沙棘属植物RAPD-PCR反应条件的优化

采用L16(45)正交试验设计研究了沙棘属植物RAPDPCR反应中DNA模板浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2 浓度和Taq酶含量等5个因素对于PCR扩增效果的影响,并对照温度梯度探讨了退火温度等热循环参数,确定适合沙棘属植物的最佳扩增体系为:模板DNA1.0mg·L-1,引物3.0μmol·L-1,dNTPs0.1mmol·L-1,Mg2 2.5mmol·L-1,Taq聚合酶8.33～16.67nkat;扩增程序中最适退火温度为35～36℃.     

干用辣椒RAPD—PCR反应体系正交优化的研究

以干用辣椒幼苗为材料,研究了干用辣椒RAPD分析过程中的Taq酶、Mg^2＋,dNTPs、引物、模板DNA浓度、退火温度等影响因素,建立适合干用辣椒RAPD反应的PCR体系,即25μL反应体系中含有解体Taq酶1．5U、Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0．6mmol／L、引物0．8μmol／L、模板DNA60ng．扩增程序为：94℃预变性4min;94℃变性1min,37℃退火1min,72％延伸1．5min,40个循环;最后72℃副延伸5min．     

新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增体系的优化

以3个新疆杏品种的叶片为试材,以其叶片基因组DNA为模板,分别对PCR扩增体系中的10×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、TaqDNA聚合酶和退火温度5个因素设计6个梯度,研究了新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增条件,建立其优化的PCR扩增体系。研究结果表明:其扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸2min,35个循环后72℃延伸10min,25μL反应体系10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP0.08mmol/L,上下引物0.16μmol/L,DNA80ng,DNA聚合酶1μL,此为最优的反应体系。     

流苏石斛ISSR-PCR反应体系的优化

以流苏石斛为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合流苏石斛ISSR-PCR分析的最佳反应体系.在20μL反应体系中含1×buffer,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 mmol/L dNTP s,1.0μmol/L引物,0.5 UTaqDNA聚合酶,10 ng模板DNA.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸45 s,共35个循环;最后72℃延伸7 min.     

铁皮石斛野生居群研究(Ⅳ):RAPD反应体系的构建与优化

为获得铁皮石斛RAPD的最佳反应体系,本文对影响RAPD反应的模板含量、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、扩增程序及退火温度等多种因子进行了构建与优化.通过各因子的组合研究,我们得到铁皮石斛RAPD反应最适扩增体系是:25μLPCR反应体积,10×Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L MgC l2,dNTP 2.5μL(各2.5mmol/L),模板DNA为30 ng,Taq聚合酶1.5 U,随机引物12 pmol,ddH2O 14.2μL.最佳扩增程序:94℃预变性3m in,94℃变性50 s,38℃复性1 m in,72℃延伸2 m in,循环40次;最后72℃延伸5 m in.4℃保存.     

地石榴ISSR扩增体系优化及应用

以地石榴为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子,如引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、模板DNA浓度、退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合地石榴的IS-SR-PCR反应体系:20μL体系中,10×buffer 2.0μL,引物0.50μmol.L-1,dNTPs 0.15 mmol.L-1,Mg2+1.2mmol.L-1,Taq DNA酶1.25 U,模板DNA 25 ng.确定了适宜的退火温度为52℃.利用该优化后的体系从60条ISSR引物中筛选出了12条,随机选取2条对10份分布于不同地区的地石榴标本基因组DNA进行扩增,证实了该体系稳定可靠,可用于进一步分析地石榴居群遗传多样性.     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为:25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2+2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。     

爱玉ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子试验和正交设计,对影响爱玉ISSR-PCR扩增效果的因素,如模板DNA用量、Taq酶用量、dNTPs浓度、引物浓度、延伸时间和循环次数等指标进行优化.实验确立了可用于爱玉ISSR-PCR分析最适宜的反应体系：20 μL反应体积中含1 ng模板DNA、1.0 U Taq酶、0.4 μmol/L引物和0.18 mmol/L dNTPs;PCR扩增程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸2.5 min,共35个循环;72 ℃延伸7min,4 ℃保存.应用该体系对14份爱玉种质进行扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

油松遗传多样性研究的ISSR—PCR体系优化与初步应用

以油松基因组DNA为模板,对影响ISSR-PCR的主要因素进行研究,建立了适宜于油松的ISSR-PCR优化体系及扩增程序;并采用lSSR标记对山西灵空山和陕西洛南2个油松种群的遗传多样性进行了分析,同时将此结果与使用RAPD标记的研究结果进行了对比.结果表明,在20μL反应体系中,模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物5种主要成分的最适浓度分别为40 ng、2.5 mmol·L-1、0.20 mmol·L-1、1 U和0.5 μmol·L-1.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30s,最适温度(54～56℃)退火45s,72℃延伸2min.共计35个循环;循环结束后72℃延伸7min,4℃保存.山西灵空山和陕西洛南2个油松种群的Nei's遗传多样性分别为0.3520和0.3514,前者的遗传多样性显著高于后者(P<0.001).使用ISSR标记与RAPD标记所获结果基本一致,但是lSSR标记优于RAPD标记.     

华山松ISSR反应体系的优化

为获得条带清晰、稳定和多态性高的华山松ISSR扩增结果,对引物、Mg~(2+)浓度和退火温度等因素进行了优化.确定了ISSR分析的最佳PCR条件:15μL反应体系中,10×PCR buffer反应缓冲液1.5μL,模板DNA 22.5 ng,Mg~(2+)2.2 mmol/L,d NTPs 0.23 mmol/L,引物0.93μmol/L,Taq DNA聚合酶0.027 U/μL.PCR反应程序为:经94℃预变性4min后,经过94℃变性30 s,Tm-4.8℃退火30 s,72℃延伸108 s共33个循环;循环结束后72℃延伸10 min.从44条ISSR引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.对华山松ISSR实验优化体系的建立,为今后利用ISSR分子标记技术开展华山松种间遗传变异分析和构建遗传图谱等研究奠定了基础.     

椭圆食粉螨ISSR-PCR反应体系正交优化试验设计

以椭圆食粉螨基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,建立椭圆食粉螨的ISSR最佳反应体系.优化得到的反应体系为:Mg2 浓度1.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U、dNTPs浓度0.2 μmol/L、引物浓度0.3 μmol/L、模版DNA量40 ng.反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,48℃、50℃、52 ℃(不同引物退火温度各异)复性1 min,72 ℃延伸1.5 min,35个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存.通过梯度退火试验,确定不同引物的最适退火温度.     

欧洲甜樱桃RAPD反应体系的建立与优化

以欧洲甜樱桃萨米托品种为研究对象,利用改进的CTAB法提取基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,筛选了模板、Mg2＋、TaqE、dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立了欧洲甜樱桃RAPD技术扩增体系．研究结果表明,在25出反应体系中,各组分最佳的浓度分别为：10×Buffer2．5μl,2．5mmol·L^-1Mg2＋2．5μl,Taq E0．06U·μl^-1,0．2mmol·L^-1dNTPs,0．2μmol·L^-1Primer,模板DNAl．2ng·μl^-1．PCR循环程序为：94℃预变性4min。94℃变性40s,36℃退火45s,72℃延伸1min,共36个循环,最后72℃延伸7min．     

濒危植物长柄双花木ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的CTAB法提取长柄双花木(Disanthus cercidifoliusvar.longipes)基因组DNA,并以此DNA为模板,对ISSR-PCR的反应体系进行了优化,建立了适合长柄双花木ISSR-PCR的反应体系和程序,即20μL的反应体系中,含模板DNA20 ng,Mg2+2.0 mmol.L-1,引物0.25μmol.L-1,dNTPs 0.20 mmol.L-1,TaqDNA聚合酶1.0 U;扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,48~54℃复性45 s;72℃延伸90 s;共36个循环;循环结束后,72℃延伸7 min.本研究为利用这一分子标记对长柄双花木进行遗传多样性分析奠定了基础.