两株紫色红曲菌根癌农杆菌介导的T-DNA转化子的生物学特性

从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的紫色红曲菌(Monascus purpureus)菌株S的转化子库中筛选出2株产红曲色素性能变化显著且遗传稳定的转化子S62和S158,分别对其菌落形态、显微结构、菌落生长速度、遗传稳定性、潮霉素抗性及其产色素和桔霉素的能力等进行了分析.结果表明,2株转化子的生物学特性均发生了显著变化,且发酵后红曲色素的色价和桔霉素的产量降低.其中:转化子S62液态发酵后色价为2.71 U/mL,仅为原始菌株S色价的0.04倍;转化子S158发酵后色价为17.62 U/mL.     

海洋真菌杀虫活性的初步研究

对采集自浙江舟山海域底泥、福建省九龙江口红树林及福建省云霄县红树林共188株海洋真菌代谢产物的杀小杆线虫（Rhabditis sp．）和卤虫（brineshrimp）活性进行初步研究．筛选出#164菌株代谢产物对小杆线虫显示了较好的杀害活性，其LC90小于0．5mg／mL．#122菌株代谢产物对卤虫显示了较强的麻痹效应．#305菌株代谢产物对卤虫的LG。仅为75μg／mL．此外，对188株海洋真菌代谢产物的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行研究．筛选出#229菌株代谢产物和#170菌株代谢产物具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性,IC50分别为30／μg／mL和25／μg／mL．这些活性菌株具有产生杀线虫剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂的特性．     

小麦异交群体长期选择早代的RAPD多态性分析

本文运用随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）标记方法,从ＤＭＡ水平对小麦异交群体４个子群体的遗传结构进行了研究．１０个引物共检测６５个位点,研究结果表明：（１）各子群体均保持了丰富的遗传变异;（２）连续五次选择对千粒重选重子群体的遗传结构影响不大;而在株高选低子群体中,随着选择次数的增加,群体的遗传变异有逐渐减小的趋势．（３）子群体间已出现一定分化但大部分遗传变异仍存在于子群体内部;其中,不同选择处理群体间的遗传距离较大,已发生了比较明显的分化;同一选择处理群体,选择次数越多,群体分化程度越大,另外,在本研究数据处理中,首次将ＲＡＰＤ谱带结果转化为基因频率分析群体遗传结构,得到与其它分析方法相吻合的结论     

一株海泥来源真菌Talaromyces flavus 210331次级 代谢产物及其抗氧化活性

为从Talaromyces 属中获得更多生物活性显著的次级代谢产物,对一株红树植物白骨 壤（Avicennia marina）根际海泥来源真菌Talaromyces flavus 210331的次级代谢产物及其抗氧化活性 进行研究。综合利用正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、半制备HPLC等色谱分离技 术,对该菌发酵产物的乙酸乙酯萃取物进行次级代谢产物分离纯化;综合运用NMR、MS波谱对纯 化的次级代谢产物进行结构鉴定,并评价鉴定次级代谢产物的抗氧化活性。结果显示从真菌T. flavus 210331 中分离鉴定 7 个单体化合物,包括 2 个异香豆素类化合物 hypoxymarin C（1）和 peniciisocoumarin F（2）,1个联烯类化合物penicilactone A（3）,4个苯衍生物diorcinol（4）、p-hydroxybenzaldenhyde（5）、trans-ferulic acid（6）和agidol 10（7）。抗氧化活性测试结果表明化合物1~3具有 显著的抗氧化活性,其IC50值分别为（0.180±0.025）、（0.180±0.037）和（0.230±0.013） mmol/L,强于 阳性对照trolox［IC50=（0.290±0.011） mmol/L］。     

青霉菌组蛋白去乙酰化酶基因的敲除及其次级代谢产物变化

丝状真菌尤其是青霉菌Penicillium代谢的各类次级产物日趋成为研制新药的重要来源，很多药物如抗癌药物、抗生素、免疫抑制剂等均来源于真菌。然而真菌次级代谢受多因素的影响，其中表观遗传修饰起到重要的调控作用。组蛋白乙酰化表观遗传修饰常与转录激活相关，从而促进次级代谢产物的合成。以青霉属真菌Penicillium christenseniae SD-193.84为研究对象，利用生物信息学手段确定其组蛋白去乙酰化酶（HDAC）基因，建立该菌中同源重组基因敲除技术，对该基因进行敲除，并比较了基因敲除前后次级代谢产物的变化，发现HDAC影响了多种次级代谢产物的合成。本研究为青霉菌分子遗传操作及次级代谢调控提供了参考。     

一株黏细菌Archangium gephyra的鉴定及其代谢产物抑菌活性的研究

对筛选获得的一株具抗真菌活性的黏细菌NX0045进行菌种鉴定,并研究其代谢产物的抑菌活性。根据子实体形态及16S rDNA序列分析鉴定NX0045;利用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和大肠杆菌为测试菌,研究NX0045代谢产物的抗细菌活性;利用白色念珠菌及酮康唑致敏的白色念珠菌为测试菌,对NX0045代谢产物的抗真菌活性进行研究。菌种鉴定结果表明NX0045为过渡原囊菌(Archangium gephyra);抑菌实验结果表明,NX0045代谢产物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和大肠杆菌均具有拮抗作用;其代谢产物单独抗真菌作用不明显,但与酮康唑具有明显的互动抗真菌活性。研究结果显示过渡原囊菌NX0045代谢产物对细菌具有较好的拮抗作用,并且具有抗真菌互动药物研究的价值。     

肌苷高产菌TSXB29的转化育种及其发酵条件的研究

以枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＸ２（遗传标记Ｘａｎ~－）为供体，以枯草杆菌ＴＳＡ１９（遗传标记Ａｄｅ~－＋Ｈｉｓ~－＋８－ＡＧ~ｒ＋６－ＭＰ~ｒ＋ＳＧ~ｒ）为受体，利用转化法成功地获得肌苷产量高、遗传稳定性好的目的转化子ＴＳＸＢ２９。采用均匀设计理论，利用微机对实验数据进行统计处理，找出了该转化子的最佳摇瓶发酵条件，在该条件下，平均产苷为２７．８５ｇ／Ｌ。经连续摇瓶和斜面传代，发现该转化子是稳定的，具有一定应用价值。     

基因枪法获得可育抗除草剂转基因小麦

用基因枪法对两个春小麦品种进行了遗传转化，获得１９株独立转化的，抗除草剂Ｂａｓｔａ的小麦植株，其中１５株自交可育，ＰＣＲ和ＤＮＡ印迹检测证实了该基因在转化植株中的表达，转基因及其表达已遗传到子三代，在已检测的７个转基因后代中，有４个植株其抗除草剂性状以单位点，显性性状的孟德尔方式遗传。     

解酯耶氏酵母产γ-癸内酯的研究进展

介绍了微生物通过β-氧化转化蓖麻油酸产生γ-癸内酯的机理和国内外对解脂耶罗维亚酵母在产γ-癸内酯方面的一系列相关研究进展,同时介绍了本研究组应用同源重组基因敲除和自克隆技术对解脂耶罗维亚酵母进行的某些基因遗传改良工作,通过本研究组的工作,应用解脂耶罗维亚酵母生产γ-癸内酯的量有了更大提高.探讨了高产γ-癸内酯酵母菌株的构建思路,以期有助于今后的研究工作.     

真菌α-淀粉酶高产菌株的诱变选育研究

以米曲霉2197为出发菌株,采用紫外线、硫酸二乙酯6、0Co-γ射线、亚硝酸、微波及离子束交替进行的复合诱变育种技术,通过平板初筛、固体麸皮初筛、固体麸皮复筛,获得一株真菌-α淀粉酶高产菌株ZLF 13,并对其进行了生活力试验和遗传稳定性试验.结果表明,突变株ZLF 13生长代谢旺盛,营养要求低,遗传稳定性好,产酶水平较出发菌株提高6.4倍,达946 u/g.     

两种辅料对固态发酵红曲米莫纳可林K与红曲色素产量的影响

红曲霉在发酵过程中会产生莫纳可林K(MK)和红曲色素(MPs)等多种对人体有益的次级代谢产物。为同时在红曲米固态发酵产物中获得一定量的MK和MPs,实验在大米基质基础上,分别添加豆粕、豆渣两种辅料,对红曲霉MPs-7进行固态发酵培养,分析两种代谢产物产量,并对辅料影响机制进行了探究。结果表明:在发酵基质中添加两种辅料均促进了MK的产生,但同时抑制了MPs的产生。豆粕添加量为质量分数15%时,发酵产物MK产量最高,但几乎无MPs产生;豆渣添加量为质量分数15%时,提高MK产量的同时也保证了一定的MPs产量,且成本比豆粕低,更适合作为辅料添加到红曲霉固态发酵基质中。研究表明:基质含氮量会影响红曲霉固态发酵过程中菌丝体量的积累,从而影响次级代谢产物的产量。     

利用根癌农杆菌介导的转化方法改良木霉菌

根癌农杆菌介导的转化系统在丝状真菌的研究中具有重要的意义。通过农杆菌介导,成功实现了丝状真菌绿色木霉菌(Trichoderma viride)遗传转化,转化率约为30～80个转化子／10^5个孢子。PCR检测和几丁质酶分析表明含有编码几丁质酶外源基因(Cli 113)的T-DNA已整合进木霉菌基因组中,而且转化子都能够稳定遗传。农杆菌介导的遗传转化方法具有转化率高、操作简便、遗传稳定等优点,在丝状真菌的遗传转化中具有重要的意义。     

Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of CryⅠA(b) gene to Trichoderma harzianum

In this study, Cry ⅠA(b) gene was successfully transferred into the biocontrol fungus Trichoderma harzianum with an efficiency of 60-180 transformants per 10^6 spores by using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Putative transformants were analyzed to test the presence of Cry ⅠA(b) gene by Southern blot. Most transformants contained a single T-DNA copy. RT-PCR analysis showed that the Cry ⅠA(b) gene was transcribed. Antifungal activities and insecticidal activities of the transformants were examined. There was no obvious difference in antifungal activities between the transformants and their wild strains. The modified mortalities of the transformants T1 and T2 were 69.57% and 91.30%, respectively. The tranformation system mediated by A. tumefaciens proved to be a powerful tool for the filamentous fungi transformation and functional genomic study with its high transformation frequency, simplicity of T-DNA integration, and genetic stability of transformants.     

烟酰胺对紫色红曲菌生长和次级代谢产物合成的影响

以北京市食品添加剂工程技术研究中心实验室保藏的 Monacolin K产量稳定的紫色红曲菌M1为出发菌株,利用紫外-可见分光光度法、超高效液相色谱法以及实时荧光定量PCR法,通过测定红曲色素含量、Monacolin K含量等,探究烟酰胺添加对红曲菌合成次级代谢产物的影响。结果表明:实验组红、橙、黄3种色素产量与对照组菌株相比均有所降低；Monacolin K产量较对照组提高了31.34%,达到124.23mg/L。电镜观察发现,实验组菌株的孢子头和菌丝体褶皱程度明显多于对照组菌株。实时荧光定量PCR发现,实验组与Monacolin K产量相关的mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG和mokH基因的表达量均呈上调趋势,而mokI基因呈下调趋势。实验以烟酰胺为添加物进行探究,以期为红曲菌培养基优化,高产Monacolin K产品筛选提供参考。     

4种培养基对红曲霉M1莫纳可林K产量影响及基因差异表达分析

莫纳可林K是红曲霉重要的次级代谢产物之一。研究了4种培养基质对红曲霉M1莫纳可林K产量的影响,并利用RT-qPCR的方法,对莫纳可林K相关基因簇mRNA水平的差异表达进行测定分析。结果表明,荞麦培养基中莫纳可林K的产量最高(8.49mg/L),其次为糙米(莫纳可林K产量7.12mg/L)、燕麦(莫纳可林K产量4.77mg/L)、大米(莫纳可林K产量2.11mg/L)。荞麦培养基利于红曲霉莫纳可林K产生。基因差异表达研究发现,除MKB与MKC基因外,其他基因的表达量均与莫纳可林K产量呈正相关;不同培养基通过刺激红曲霉基因表达从而影响其次级代谢产物产生。     

T-DNA transfer and integration as a tool for insertional mutagenesis in the taxol-producing fungus

Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transformation method was applied to transform Nodulisporium sylviforme fusant HDF-68, a taxol-producing fungus. We constructed a binary vector pBI121-43 carrying a hygromycin-resistant gene cassette between the right and left borders of T-DNA. Optimal co-cultivation of N.sylviforme with A.tumefaciens containing pBI121-43 led to 110～130 hygromycin-resistant transformants per million conidia. Putative transformants were found to be mitotically stable. The molecular analysis of transformants demonstrated the random integration of single copy of the T-DNA into the host genome. This transformation system serves as a basic tool for insertional mutagenesis in N.sylviforme fusant HDF-68, and the development of such system lays a solid foundation for constructing high-yied gene engineering strain and clarifying taxol biosynthesis pathway in this fungus.     

红曲色素稳定性研究

本文研究了温度、ｐＨ、光照、金属离子对作者通过液体发酵法所得的红曲色素包括红曲黄色素和红由红色素稳定性的影响，结果表明红曲黄色素在酸性条件下比较稳定。红白色素的耐热性较差，红白色素受室内自然光的影响较小，但在室外自然光的直射下失色严重。Ｆｅ３＋，Ｆｅ２＋对色素的稳定性影响较大，其它金属离子的影响较小。     

TAIL-PCR技术获取树状多节孢融合子的FSTs序列

采用TAIL-PCR技术,对随机选取的 6 个HDF-68阳性T-DNA转化子进行扩增,只利用1 d的时间,即获取了T-DNA标签侧翼序列（FSTs）,对其序列进行分析后,分析了影响TAIL-PCR扩增的主要因素.该项研究,为从T-DNA的突变子中分离紫杉醇产生菌产紫杉醇的相关基因提供了一条可行途径,也为阐明紫杉醇产生菌的代谢途径以及最终构建高产基因工程菌株奠定了基础.     

发酵米糠的制备及其降血脂功能的研究

利用红曲霉(Monascus anka)、黑木耳(Auricularia auricular)、紫芝(Ganoderma japonicrn)3种真菌对新鲜米糠进行固态发酵,并对发酵产物的降血脂功能进行研究.结果表明:黑木耳和红曲霉在米糠上长势良好,且由两者发酵过的米糠脂肪含量显著降低,碳水化合物显著增高.高脂小鼠饲喂实验表明:与新鲜米糠相比,黑木耳发酵米糠和红曲霉发酵米糠均能够显著降低高脂小鼠的体质量和肝脏指数;饲喂黑木耳发酵米糠的高脂小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量分别降低了28.84%、37.33%和56.19%,差异显著(P<0.01),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量变化无显著差异.小鼠肝组织HE染色结果表明,黑木耳发酵米糠能有效减轻高脂小鼠肝组织损伤程度.