携带TIMP-1基因逆转录病毒载体的构建及其实验研究

构建携带组织金属蛋白酶抑制物ＴＩＭＰ－１基因的逆转录病毒载体，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的变化．利用常规分子克隆技术，通过对逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ（Ｆ６）质粒的去磷酸化、粘端连接，构建ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ；经限制性内切酶酶切、电泳鉴定其结构正确后，用电穿孔法对体外培养的ＰＡ１３７包装细胞进行基因转移，Ｇ４１８筛选阳性克隆，收集上清，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系的研究．构建获得ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ，有效滴度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ～１０６ＣＦＵ／ｍＬ．本研究构建获得的ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体，在感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的研究中得到有效应用     

大肠癌中MTA1和nm23 - H1蛋白的表达及其意义

目的：探讨大肠癌中MTA1、nm23-H1蛋白的表达及其意义。方法：用免疫组化留法检测84例大肠癌MTA1、nm23-H1蛋白的表达。结果：84例大肠癌中MTA1、nm23-H1阳性表达率分别为61．9％和51．2％;MTA1高表达与大肠癌组织分化程度、Duke’s分期和淋巴结转移关系密切（P〈0．05）;nm23-H1低表达与大肠癌组织分化程度、Duke’s分期和淋巴结转移关系密切（P〈0．05）;大肠癌中MTA1和nm23-H1蛋白表达呈负相关（P〈0．05）。结论：MTA1和nm23-H1蛋白表达与大肠癌分化程度、淋巴结转移和预后密切相关,可作为判断大肠癌患者转移复发的参考指标。     

NM23—H1和NM23—H2可切割血小板起源的生长因子—A基因启动子中的核酸酶敏感成发

PDGF－A基因的转录由几个GC丰富的、高度单链的、非B型结构的增强子和沉寂成发所调节，其中一个沉寂子位于PDGF－A启动了远上游5′端（－1418－1388），命名为5′SHS。重组人NM23－1T上和NM23-H2可分别在3′和5′端切割单链、双链形式的5′SHS的两条链，表明NM23－H1和NM23－H2在不同位点，以不同机制切割5′SHS.NM23－H1和NM23－H2也可分别在3′和5′端切割双链形式的PDGF－A启动子中的NHE成分（－82－－50）；此外，NM23－H1也可在3′端切割PDGF－ANHE成分的无意义链（Py链）。     

蓝细菌新质粒载体pPRS—1的构建

以蓝细胞Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ ｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ．ｃａｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａＩ分别消化，经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ＾ｒＴｅｔ＾ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａＩ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子     

nm23-H1基因与人早幼粒白血病细胞HL-60增殖的相关性分析

目的探讨nm23-H1基因的表达与白血病细胞HL-60增殖之间的关系。方法：以25ng／mL阿糖胞苷处理HL-60细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,NBT还原比色法判断细胞分化状况,RT-PCR检测nm23-H1基因表达的变化;构建nm23-H1基因的真核表达质粒pEGFP-N1-nm23-H1,转染HL-60细胞,通过细胞生长曲线和血清依赖性实验检测nm23-H1基因的过表达对HL-60细胞生长的影响。结果：小剂量Ara-C对HL-60细胞的生长呈时间依赖性抑制,作用4d后细胞NBT还原能力增强且nm23-H1基因的表达下调;转染nm23-H1基因的HL-60细胞生长加快、血清依赖性下降。结论：Ara-C对HL-60细胞增殖的抑制作用与下调nm23-H1基因的表达有-定关系;nm23-H1基因在HL-60细胞中的过表达有促细胞增殖的作用,即增高了HL-60细胞的恶性程度。     

鼠转移抑制基因（nm23－1）在大肠杆菌中的高效表达及活力鉴定

肿瘤转移是引起恶性肿瘤患者死亡的主要因素［１］。对肿瘤抑制基因的研究在临床上具有重要意义。ｎｍ２３基因是目前研究得较多和认为最有前途的肿瘤抑制基因，它已从小鼠黑色素瘤细胞系Ｋ－１７３５中克隆得到。有证据表明，来源于人的ｎｍ２３－Ｈ１和ｎｍ２３－Ｈ２基因的氨基酸序列分别与人红细胞ＮＤＰＫ的两个亚基Ａ、Ｂ等同，且与果绳ａｗｄ基因高度同源。本实验利用ｐＥＴ表达系统在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达了重组ｎｍ２３－１（鼠源），ＳＤＳ－ＰＡＧＥ扫描结果显示，表达量高达４３．２％。并对其表达产物进行了分离纯化和活力测定，证实ｎｍ２３－１蛋白确实具有ＮＤＰＫ的功能，从而为进一步探讨ｎｍ２３基因家族在抑制癌细胞转移方面的功能打下了良好的基础。     

人endostatin基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中表达

为探讨转人血管内皮抑制基因（endostatin）在转染细胞中的表达，利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒，通过脂质体（lipofectamine）将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液。用重组病毒液感染NIH3T3细胞，经G418筛选获得转入endostatin基因细胞株NIH3T3-endo。同法制备对照细胞株NIH3T3-pLncx.PCR检测NIH3T3-endo细胞基因组，在扩增产物中一份550bp人endostatin基因特异性片段，对照组为阴性。免疫组化测定示仅NIH3T3-endo细胞中有外源性endostatin蛋白的表达，说明人endostatin基因已被成功导入NIH3T3细胞，并获得稳定表达。     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1。PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列。并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中。因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达。     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1.PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列.并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中.因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达.     

Nm23-H1 基因在膀胱移形细胞癌中的表达及意义

膀胱移行细胞癌石蜡包埋标本62例，正常对照标本9例，采用免疫组化SP法研究nm23-H1基因表达与膀胱癌分级、分期、复发及转移的关系。结果表明：nm23-H1基因在62例膀胱癌中的阳性表达率为66．1％，阳性表达率随膀胱移行细胞癌分级、分期的增高而增高，而随复发及转移的增多而降低。因此推论，nm23-H1基因在膀胱移行细胞癌形成过程中起促进作用，而在复发和转移过程中起抑制作用。可作为评价膀胱癌恶性度、肿瘤进展的指标。     

人肿瘤细胞株中细小病毒H—1的DNA扩增与非结构蛋白NS—1基因的表达

研究三株人癌细胞和两株对照细胞对细小病毒Ｈ－１杀伤作用敏感性的分子机制．表明了在感染复数ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）为５ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）／细胞的情况下，作为Ｈ—１病毒复制受纳细胞的人肝癌细胞株ＯＧＹ－７７０３和人胃癌细胞株ＳＧＣ—７９０１，能够支持病毒ＤＮＡ扩增和非结构蛋白ＮＳ—１基因的表达，这和作为阳性对照的由ＳＶ４０转化的新生儿肾细胞株ＮＢ—Ｋ一样，但对Ｈ—１病毒感染有抗性的人肾癌细胞株ＯＵＲ—１０和它的对照人胎肾细胞株ＨｕＫ—１，并不支持病毒ＤＮＡ扩增和ＮＳ—１蛋白的表达．本文结果指出，细小病毒Ｈ—１的杀伤作用与细胞中的病毒ＤＮＡ扩增及ＮＳ—１基因表达的程度相关．     

新基因hSSB1逆转录病毒载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

 hSSB1 (Human Single strand DNA binding protein) 是参与细胞DNA损伤应答的一个重要信号分子。根据GenBank 提供的hSSB1基因序列扩增其cDNA序列,插入到pBABE逆转录病毒载体中, 连接后的质粒转化后经过双酶切,PCR扩增及测序来鉴定pBABE-hSSB1阳性克隆。将阳性表达的pBABE-hSSB1和包装质粒转染到HEK293T细胞中,产生病毒液。将包装好的病毒感染细胞并用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定表达hSSB1的细胞株。重组pBABE-hSSB1质粒经双酶切,PCR扩增鉴定及DNA测序分析等方法证实克隆成功。Western blotting检测发现转染重组质粒pBABE-hSSB1的细胞株中hSSB1蛋白的表达水平高于对照组。该研究成功构建了针对hSSB1基因的逆转录病毒载体(pBABE-hSSB1),并得到了稳定高表达hSSB1的细胞株, 为深入研究其功能奠定了基础。     

温控表达载体的构建及HIV—1 p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐＢＶ２２０和ｐＥＴ２８，构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５，记载体携带ＰｒＰｌ串联温控启动子以及Ｈｉｓ－Ｔａｇ的纯化标签、利于目的蛋白的表达与纯化。将ＨＩＶ－ ｌｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列分别插入到ｐＶＶ５ｂ，ｐＥＴ２８ｂ的相应位点，构建了重组表达质粒ｐＥＧ１ｂ，ｐＢＧ７ｂ，二者在不同受体菌中，表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的４２％和２８％。     

NM23-H1和NM23-H2可切割血小板起源的生长因子-A基因启动子中的核酸酶敏感成分

PDGF A基因的转录由几个GC丰富的、高度单链的、非B型结构的增强子和沉寂成分所调节 其中一个沉寂子位于PDGF A启动子远上游 5’端 (- 14 18～ - 1388) ,命名为 5’SHS .重组人NM 2 3 H1和NM 2 3 H2可分别在 3’和 5’端切割单链、双链形式的 5’SHS的两条链 ,表明NM 2 3 H1和NM 2 3 H2在不同位点 ,以不同机制切割 5’SHS .NM 2 3 H1和NM 2 3 H2也可分别在 3’和 5’端切割双链形式的PDGF A启动子中的NHE成分 (- 82～ - 5 0 ) ;此外 ,NM 2 3 H1也可在 3’端切割PDGF ANHE成分的无意义链 (Py链 )     

人α－干扰素基因在小菜蛾细胞中的表达及其影响因素探讨

将含有人α－干扰素（ＩＦＮα）基因的杆状病毒转移载体（ｐＡｃ３７３－ＩＦＮα）与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－Ｐｘ２－ＨＮＵ３,Ｐｘ）,空斑纯化后,利用细胞致病效应（ＣＰＥ）抑制法检测得到了干扰素效价（６８７２．６ＩＵ）,证明得到了可以在Ｐｘ细胞中表达ＩＦＮα的重组病毒（Ａｃ－ＩＦＮα）．并探讨了培养温度和血清浓度对ＩＦＮα表达水平的影响,结果表明：在２８℃时,培养基中补加２％的小牛血清,可获得最高的ＩＦＮα效价（１７４３５．９ＩＵ）．     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri的构建及鉴定

构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-c1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础.用亚克隆法,将目的片段egfp-c1-hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上,用酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,用800 mg/L G418筛选2周后,在荧光显微镜下检测其表达.双酶切鉴定得到pLNCX-EGFP-C1-hri阳性克隆,荧光显微镜显示绿色荧光在B16细胞质中高效表达.成功构建逆转录病毒表达载体pLNCX-EGFP-C1-hri.     

OsICK1 基因植物反义表达载体的构建及遗传转化

OsICK1是水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因.我们构建了水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因(OsICK1)的植物反义表达载体,在农杆菌的介导下尝试使antisense OsICK1 整合到水稻基因组中并初步得到验证.为进一步研究OsICK1 对水稻细胞周期调控的作用奠定了基础.     

无血清微载体培养MDCK细胞和甲型流感病毒H1N1的条件优化

 血清微载体培养MDCK细胞,并接种流感病毒H1N1,优化培养条件,为细胞流感疫苗的工艺研发奠定基础.采用不同的细胞接种量在50mL无血清微载体搅拌瓶中培养MDCK细胞,并接种甲型流感病毒H1N1,检测不同pH值和TPCK-胰酶含量的病毒培养液,不同病毒接种量,补加TPCK-胰酶,以及不同收毒时间对血凝效价的影响.以1.0×10⁵mL^-1的MDCK细胞数量接种到无血清微载体上,病毒培养液pH值为7.2~7.4范围内,TPCK-胰酶质量浓度为1.0μg/mL,接种后不补加胰酶,病毒接种量MOI=1.0,并在72h收获,最高血凝效价达到512.由此获得了在无血清为载体上培养MDCK细胞和甲型流感病毒H1N1的适宜条件.     

IL—2与猪瘟病毒E2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用的研究

应用DNA重组技术构建了猪瘟病毒E2基因与IL－2基因的双表达真核表达载体,观察其表达水平,并对其免疫增强效果进行了观察,结果是构建了猪瘟病毒E2基因与白细胞介素－2的真核表达质粒pIRST IL-2。将质粒转染BHK－21细胞,可在体外表达E2和有生物活性IL－2,pIRST IL-2质粒能诱导产生CSFV的特性免疫反应,pIRST IL-2所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒pIRST强,实验表明,IL－2与猪瘟病毒E2基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果。     

人类8型疱疹病毒K1基因真核表达载体的构建

为构建人类8型疱疹病毒(Human herpesvirus 8,HHV-8)K1基因的真核表达载体,采集卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)患者血清,采用柱式病毒DNA抽提试剂盒抽提血清中的病毒DNA,采用套式PCR技术检测HHV-8的特异性片断KS330233以判断是否得到了HHV-8 DNA,采用PCR技术扩增HHV8 K1基因并纯化回收,酶切、连接入真核表达载体pcDNA3.1,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆pcDNA3.1/HHV8-K1扩增后,提取质粒,进行双酶切和DNA测序鉴定.结果显示采集了经典型KS血清3例,提取了血清HHV-8DNA,扩增了特异性片断KS330233,测序结果正确提示我们得到了HHV8 DNA,扩增了HHV8 K1基因,构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性.由此可知:成功构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定良好的实验基础.