mRNA差异显示技术及其在植物基因工程中的应用

mRNA差别显示技术是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，目前已广泛应用于分离鉴定组织特并性表达的基因．本文介绍了mRNA差别显示的基本原理、技术路线以及反应条件的改进方法，最后指出了此技术在植物基因工程中的应用．     

一种优化的mRNA差异显示技术分析白刺盐碱胁迫表达相关基因研究

mRNA差别显示PCR技术是分离、检测差异基因表达的有力工具 我们研究了存在的可能影响DDRT-PCR研究结果的因素 通过改变DDRT-PCR方法中的引物、PCR反应中的退火温度等条件,得到了一种优化的DDRT-PCR技术,运用该项技术研究了白刺盐碱胁迫相关基因的差异表达 结果发现,运用这种方法得到的差异表达基因片段假阳性率较低,且差别条带较长,多为800bp以上,克服了DDRT-PCR技术中的主要问题,为更广泛地运用该项技术奠定了基础     

用cDNA-AFLP银染技术研究与花椰菜花色相关的基因

将smart cDNA PCR和AFLP银染技术结合，建立了一种新的mRNA差别显示技术，用这种方法对花椰菜黄花和白花的两个近等基因系进行了研究，找到一条差异带，经过Northern点杂交检测，发现此带为白花株系特有的谱带。     

用差异显示技术分离空心莲子草抗旱相关基因

采用mRNA差异显示技术,分离空心莲子草在干旱胁迫1 d后差异表达的基因,获得139个基因片段.经过Reverse Northern检测,初步证实有两个片段受干旱诱导表达上调.对其中一个片断克隆测序并进行核甘酸序列比对,显示与其他基因同源性都很低,表明可能是新的基因.半定量PCR技术证实该基因受干旱诱导表达上调.     

辛伐他汀对高胆固醇血症小鼠肝脏基因表达的影响

采用抑制消减杂交方法结合targeted display法分离鉴定辛伐他汀处理高胆固醇血症小鼠后差异表达的基因,并采用定量RTPCR方法对utrophin、TNF-α的mRNA转录水平进行了研究.结果表明辛伐他汀处理后7个基因上调表达,19个基因下调表达;这些基因涉及转录、脂质代谢、免疫反应等过程.定量RT-PCR分析显示utrophin与TNF-α的mRNA转录水平降低.     

mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异

mRNA差异显示技术已经广泛应用于研究植物、动物和微生物在各种环境条件下基因的差异表达研究.研究以15℃和30℃培养的深黄被孢霉M6-22菌体为材料,利用mRNA差异显示技术研究两种培养条件下基因的表达差异.经实时荧光定量PCR验证,共获得7条差异片段,相似性搜索结果表明它们是6-磷酸葡萄糖异构酶、单糖核苷酸转运蛋白、Ras1鸟苷酸转移因子、依赖于NAD的苹果酸脱氢酶、Δ12-脂肪酸脱氢酶、CLK4关联的丝氨酸/精氨酸丰富蛋白和假定蛋白,涉及糖酵解、蛋白质修饰、信号传导、脂肪酸合成和mRNA加工等生命过程,表明深黄被孢霉M6-22低温适应性是多种途径协同调控的结果.     

一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭(Anas platyrhynchos domesticus)和绿头野鸭(Anas platyrhynchos)卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA(同源性为96%)、褐家鼠睾丸cDNA(同源性为83%)有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离

以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用种属相似性设计了一对引物,采用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA和cDNA全序列.测序表明:克隆得到的DNA序列全长2 924 bp,cDNA序列全长2 583 bp,编码860个氨基酸.编码序列推导的蛋白质序列相似性分析显示:完整蛋白质序列同源性高达97%～99%.该研究为β-葡萄糖苷酶基因的遗传转化及应用 奠定了基础.     

RNA干扰技术及其在医学研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象.RNAi主要通过核酸酶Dicer切割dsRNA生成21-23 nt的小干扰RNA(siRNA),继而由siRNA识别并靶向降解同源靶基因mRNA,从而抑制靶基因的蛋白表达.近年来,RNAi技术在医学研究中的广泛应用均取得了显著的基因沉默效果,RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段.文中综述了该技术在医学研究中的应用.     

KIF4A mRNA在肺癌组织中表达水平的研究

收集肺癌组织标本和正常肺组织标本,提取组织中的RNA,通过反转录PCR合成cDNA,进行实时定量PCR测定.结果表明:31例肺癌组织中有29例KIF4A mRNA的表达量高于正常组织,其中26例(83.87%)比正常组织高2倍以上,10例(32.30%)比正常组织高4倍以上;KIF4A mRNA的表达量与肿瘤淋巴结转移(TNM)分期的相关性具有统计学意义(F=0.565,P=0.029).由于肺癌组织中KIF4A mRNA的表达量升高与肿瘤的分期分型相关,因此可以作为判断肺癌分期及预后的新分子标志物,对于评估肺癌的发生与发展也可能具有重要意义.     

竞争性RT-PCR检测哮喘患者IL-8表达水平

利用反向ＰＣＲ法,缺失人ＩＬ－８ｃＤＮＡ内部ｂｐ６邓列,构建得到ＩＬ－８突变内标分子。用已知最的该内标分子,通过竞争性ＲＴ－ＰＣＲ法,检测支气管哮喘患者外周血ＩＬ－８基因的表达情况,发现患者Ｌ－８ｍＲＮＡ的表达水平明显高于正常人对照组,这一结果初步表明,利用竞争性ＲＴ－ＰＣＲ技术对支气管哮喘患者进行早期基因诊断,具有一定的可行性。     

PAMD对缺血性脑损伤Bcl-2和Bax基因表达的作用

探讨蝙蝠葛酚性碱预处理对脑缺血后大脑皮质神经元Bcl-2和Bax基因表达的影响．采用Zea Longa等介绍的线栓阻塞大脑中动脉方法制备大鼠脑缺血模型,并用受试药物术前连续预处理模型大鼠7d．采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法测定假手术组、模型组和蝙蝠葛酚性碱高、中、低剂量、尼莫地平、银杏叶片预处理组大鼠缺血后24h大脑皮质中Bcl-2和Bax的mRNA表达变化．行大脑中动脉闭塞后24h大鼠大脑皮质神经元Bcl-2和Bax的mRNA均被诱导表达,Bcl-2 mRNA表达量下降;而Bax mRNA表达量升高．蝙蝠葛酚性碱预处理7d后,缺血后24h大鼠大脑皮质神经元Bcl-2 mRNA表达水平较模型组明显上调,而Bax mRNA表达于缺血后24h明显下调．蝙蝠葛酚性碱能有效调控缺血脑损伤后大脑皮质神经元Bcl-2和Bax的基因表达水平,从而在缺血性脑损伤中起到神经保护作用．     

雌激素受体α检测方法研究进展

综述了雌激素受体α的检测方法及其研究进展,详细介绍了免疫组织化学、逆转录-聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹、微流控芯片等方法的研究现状,并做出了展望．     

Inhibition of M-MuLV reverse transcriptase activity by fullerene derivatives

The biological properties and biomedical application of fullerene (C60) and its derivatives are currently very active subjects concerning fullerene research. The bio logical effects of fullerene and its derivatives include enzyme inhibition, sites-selective DNA cleavage, antibacterial and antiviral activities, photocytotoxicity and antiapoptosis[1―4]. Especially, enzymes inhibited by fullerene derivatives mainly consist of oxidation-reduc- tion related enzymes such as glutathione transferase…     

甘蓝磷酯酶D HKD2功能区基因片段的克隆与反义表达载体的构建

以甘蓝(Brassiaca oleracea)为材料，取幼叶分离mRNA，反转录合成cDNA，以cDNA第一链为模板，通过PCR扩增，获得甘蓝磷酯酶D(Phosphorate　Lipid　Dehydrolase，PLD)HKD2功能区的基因片段．对其进行Blast分析，结果表明，分离的目的片段核苷酸序列与Genbank中报道的甘蓝PLD基因相比同源率为99．7％，只有2个碱基发生改变．将得到的PLD基因片段插入植物表达载体pAT940，构建了PLD基因反义表达载体pATC—rPLD，为下一步进行抗逆转基因作物选育打下基础．     

用差异显示反转录PCR银染技术研究小鼠前胃癌相关基因

目的:以N-亚硝基-肌氨酸乙酯(NSEE)作为诱变剂建立NIH小鼠前胃癌动物模型,研究小鼠前胃癌差异表达基因,探索细胞癌变的分子机理.方法:采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)、反向Northern点杂交、克隆、测序和生物信息学分析等方法,对其癌变组织中差异表达的基因进行系统的研究分析.结果:得到5条在小鼠前胃正常对照组织、癌变组织之间差异表达的cDNA片段.筛选后,对其中3个差异条带进行DNA序列测定,有1个与已知基因Tpt1高度同源,2个与同1基因片段AK085193.1高度同源.提示这2个基因与小鼠前胃癌的形成有关.     

At3g13600截短型蛋白的原核表达载体的构建

拟南芥基因At3g13600编码一种钙调素结合蛋白,序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 818 bp,编码一个具有606个氨基酸残基的多肽,推测分子量为68.9 kD;在At3g13600蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特性,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)扩增含...