LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因

Halobacterium species xz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌，所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视．连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法．LPA法利用“酶切-连接-PCR”之组合，首先选定一组限制性内切酶，各自单独地酶切细菌总DNA样品，然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接．连接液混合起来，作为扩增未知序列DNA的模板．通过这种方法，克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0．4kb上游调控区域的总长度1．3kb的DNA片段．实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法，可以快速有效地获得目标基因相关的序列．     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5'端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1042bp的特异性片段,连接到pMD19T载体中获得该片段克隆．经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段．DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5＇端调控区序列相比具有很高的一致性．研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础．     

水稻硝酸还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA.用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含1 376个核苷酸对;应用NCBI网站的BLAST软件对本试验中克隆的序列与GenBank(NC_008401)公布的水稻硝酸还原酶基因启动子序列进行比对,有3个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻硝酸诱导基因启动子.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box).此序列的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

编码普通野生稻磷酸盐转运蛋白基因片段的分离与克隆

以云南普通野生稻基因组DNA为模板，根据GeneBank中登记的编码小麦高亲和力磷酸转运蛋白基因保守序列设计一对特异引物，利用多聚酶链反应技术（PCR），扩增出目标基因（cwrpt)1002bp长度的基因片段并克隆到载体pGEM-T。经DIG标记探针杂交检测初筛，限制性内切酶酶切，PCR扩增，DNA序列分析与可能氨基酸序列同源性比较，此推定的氨基酸序列与小麦，水稻，拟南芥，番茄磷酸转运蛋白同源性很高，初步认为此基因片段为普通野生稻耐低磷胁迫相关磷酸盐转运蛋白的编码基因，获得全长序列与基因表达的进一步研究正在进行中。     

盐藻启动子活性片段的克隆及序列分析

报道了以启动子探测质粒pECE7为载体克隆盐藻（Dunaliella salina)中具有启动子活性DNA片段的研究。经限制性内切酶EcoR I分别消化盐藻基因组DNA和质粒pECE7,并进行体外重组及转化筛选，得到一具有启动子活性的DNA片段Ped。经进一步氯霉素抗性筛选，证明此启动子具有较高的活性。测序结果显示Ped长243bp。对其序列分析表明它具有启动子初级结构的基本特征。Southern杂交显示此启动子片段确实来自于盐藻基因组，且其广泛存在于整个基因组中启动盐藻基因的表达。经推测，Ped中含有多种转录因子结合位点的同源序列，因此Ped可能参与了多基因表达的调控。     

甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV）gp 37基因的克隆及序列分析

通过鸟枪法克隆了甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV)基因组DNA EcoR I酶切的2．2kb片段,序列分析表明,该片段含有gp37基因,SeMNPV gp37基因的开放阅读框为801个核苷酸,编码268个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为30400,在gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期基因启动子序列ATAAG,同其它昆虫杆状病毒和昆虫痘病毒GP37／Fusolin蛋白的比较结果表明,SeMNPV GP37与已知gp37/fusolin基因的氨基酸序列同源性较高（50－68％）,在其蛋白序列内存在类似的保守区和可能的N－连接糖基化位点,在SeMNPV gp37基因下游存在一个完整阅读框和部分get基因序列。     

厚叶旋蒴苣苔BcWRKY2基因5''端调控区的克隆及功能元件分析

在克隆厚叶悬蒴苣苔干旱诱导表达转录因子BcWRKY2基因的基础上,利用接头介导的PCR(LM-PCR)技术,从基因组DNA中克隆了908bp的BcWRKY2基因的上游调控区序列.序列分析显示,该启动子中存在多种非生物胁迫反应元件,如ABA反应元件ABRE、干旱反应元件DRE/C-repeat以及MYB结合位点MBS(MYB binding site involvedin drought-inducibility)等.     

中国4个两性生殖卤虫品系的ISSR指纹分析

根据微卫星DNA序列设计了10种ISSR引物，对中国4个两性生殖卤虫品系的亲缘关系进行了分析．用10种ISSR引物对卤虫基因组DNA进行扩增，共获得188条清晰稳定的条带，75个基因座位，其中有99条多态性片段，53个多态性座位，片段长度在2000-150bp之间．聚类分析结果表明：3个内蒙品系卤虫亲缘关系较近，当遗传相似系数为0．5333时，明显把来自内蒙古和西藏的卤虫分为2个类群．     

厚叶旋蒴苣苔BcWRKY2基因5′端调控区的克隆及功能元件分析

在克隆厚叶悬蒴苣苔干旱诱导表达转录因子BcWRKY2基因的基础上,利用接头介导的PCR(LM-PCR)技术,从基因组DNA中克隆了908bp的BcWRKY2基因的上游调控区序列。序列分析显示,该启动子中存在多种非生物胁迫反应元件,如ABA反应元件ABRE、干旱反应元件DRE/C-repeat以及MYB结合位点MBS(MYB binding site involved in drought-inducibility)等。     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

产气荚膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术，从C型产气荚膜梭茵中国标准株C59-44基因组DNA中扩增出了约0．7kb的基因，并将其克隆到pGEM-T栽体上，经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明，该基因片段的核苷酸序列与国外报道的β2毒素基因序列一致．     

Q&A

<正>Q:基因工程用的目的基因如何从基因文库中准确获取?(读者:杨博)A:DNA文库是一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群。在构建文库的时候,我们先提取某一生物体的基因组DNA,然后用限制性内切酶把基因组DNA剪成很多片段,这些片段大小适中,通常为一两万个碱基对,以便于后续处理。接下来通过连接酶把这些片段和载体连起来。载体是一类人工改造过的DNA分子,通常为环状。片段化了的DNA必需和载体连接,因为载体能为这些DNA片段提供复制等能力。由于这一物种的基因组DNA被片段化了,每一个片段和一个载体连成了一个克隆     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

茄子反转录转座子基因片段的克隆及序列分析

根据己报道的反转录转座子的序列设计合成一对特异引物,以西安绿茄基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法扩出一条DNA特异片段并克隆到pMD18-T载体中.用PCR法和酶切分析法对克隆片段进行鉴定并进一步进行核苷酸序列分析.序列测定该片段长为518 bp.用GenBank中的BLAST程序分析表明,该片段与马铃薯(Solanum demissum)反转录转座子的gag-pol聚合蛋白90-243aa区域氨基酸同源性为43%.     

苦瓜(Momordica Charantia L.) MADS-box基因BAG启动子的克隆分析及表达载体的构建

作者提取苦瓜基因组总DNA，构建了DNA步移文库，并根据已克隆并公布的苦瓜MADS-box基因BAG的基因序列设计引物，通过染色体步移技术克隆出BAG基因起始密码子上游调控序列BAGP．对BAGP的鉴定和分析表明其具备大多数高等植物启动子的保守元件，预测它对BAG基因的表达具有一定的作用．为鉴定BAG基因的基本启动子元件。将基因5′侧翼序列做缺失片段分析，利用PCR方法从BAGP中得到3个大小不等两端带有HindⅢ,BamHⅠ酶切位点的片段BAGPl，BAGP2和BAGP3，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报告基因GFP的植物表达裁体BAGPVl，BAGPV2和BAGPV3．     

嗜麦芽黄单胞菌CG样受体跨膜域克隆与分析

根据已知生物LH/CG受体同源性较大的跨膜域序列设计引物，以嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，将约600bp目的产物克隆到pUCm-T载体上，经酶切及PCR扩增筛选鉴定得到重组质粒pUCm-Rec，以DIG标记的PCR扩增片段作为探针进行DNA斑点杂交，确证目的PCR扩增片段与该菌染色体DNA有同源性，克隆到的593bpCG样受体跨膜域序列在GenBank中的注册号为AY355346，再以地高辛标记的593bp跨膜域序列为探针，从构建的该菌基因组文库中，筛选到可能与CG样受体属于同一跨膜受体家族的编码组氨酸激酶／效应调节杂合蛋白部分序列的685bp核酸片段(其在GenBank中的注册号为AY359445)。     

hTR基因反义表达质粒构建及序列分析

从人的脐带血管内皮细胞中提取基因组 DNA,通过 PCR方法扩增得到了人端粒酶RNA成分 ( human telomere RNA,h TR)的基因片段 ,扩增产物经酶切克隆到逆转录病毒载体p LNCX上 ,构建了 h TR基因的反义表达质粒 .序列分析结果表明 ,PCR扩增得到的 h TR基因的 DNA序列与所发表的序列完全一致 .构建的反义表达载体中的目的基因正确地反向插入到逆转录病毒载体 p LNCX的克隆位点上 ,构成了 h TR基因的反义表达质粒     

盐生盐藻肌动蛋白基因及其5′上游片段的克隆

在盐生盐藻 c DNA文库和基因组文库中对肌动蛋白基因进行了筛选 ,结果得到了一个c DNA克隆和两个基因克隆 ,并进一步从基因克隆中克隆出该基因的 5′上游片段 .检索结果表明 ,所得到的 c DNA和基因属于盐生盐藻的肌动蛋白基因 .通过将盐生盐藻肌动蛋白基因序列同其c DNA序列及其他生物的肌动蛋白序列相比较 ,给出了一个此基因 5′上游区大概的结构