一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

一种新的有机磷降解酶的分离纯化及酶学性质研究

从农药厂被污染的土壤中分离到一株降解有机磷农药的高效菌株C2-1, 经鉴定表明为假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes). 对其产生的有机磷降解酶OPHC2进行了分离和纯化, 并对其酶学性质进行了研究. 其降解甲基对硫磷的最适温度为65℃, 最适pH为9, 并且此酶具有很好的热稳定性和pH稳定性, 对大多数金属离子和化学试剂不敏感. OPHC2氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列分析表明, OPHC2与目前发表的有机磷降解酶没有同源性.     

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转移酶DctPQM的跨膜结构分析与功能研究

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸转移酶系由dctPQM基因编码. 基因序列和结构分析表明, dctP, dctQ和dctM紧密连锁, 并在核苷酸和氨基酸水平上与自生固氮菌棕色固氮菌的四碳二羧酸结合蛋白基因dctP和转运蛋白基因dctQM高度同源. 经分析表明, DctP不含跨膜区, DctQ包含5个跨膜区, DctM包含12个跨膜区. 为验证四碳二羧酸转运系统对固氮能力的增强作用, 将含有完整dctPQM基因的DNA片段连接在自杀性转移质粒载体pSZ21的Tn5转座区域中, 获得重组质粒pSZY6. 采用三亲接合方法, 经Tn5转座作用将dctPQM基因随机插入到野生型菌株A1501的染色体上, 构建了重组菌株A-142. 经nptⅡ基因的PCR扩增实验证明, 该重组菌株确实携带了额外拷贝的dct结构基因. 该重组菌株以不同浓度的琥珀酸、延胡索酸和苹果酸(20, 10和5 mmol/ L)为惟一碳源生长时, 其固氮活性均明显高于野生型菌株A1501, 表明额外拷贝的四碳二羧酸转移酶系编码基因dctPQM能增强受体菌的固氮能力.     

耳蕨属(鳞毛蕨科)的亚洲起源: 来自rbcL序列的证据

对60种(包括新测定的我国西南部的耳蕨和贯众属植物23种)广义耳蕨属Polystichum sensu lato (s.l.)植物的rbcL基因序列进行系统发育分析, 并根据通过相对速率检验支系之间的遗传距离和rbcL基因的进化速率, 估算广义耳蕨属起源和发生分歧的时间. 用最大简约法(MP)和邻接法(NJ)构建的系统发育树基本一致, 所分析的广义耳蕨属(包括贯众属Cyrtomium和鞭叶蕨属Cyrtomidictyum)构成一个单系群, 支持广义耳蕨属的成立. 位于系统树基部的支系均由来自亚洲的种类构成, 而来自全世界各地的其余种类构成另一个支系. 系统发育分析及分歧时间的估算结果显示, 广义耳蕨属在晚白垩世晚期(约76 Ma)首先从亚洲起源, 在始新世早期(约46 Ma)扩散到世界各地.     

假根羽藻(Bryopsis corticulans)LHCⅡ的聚集态对Chl a电子激发态性质的影响

采用稳态吸收、荧光和皮秒时间分辨荧光光谱手段研究了假根羽藻(Bryopsis corticulans)捕光色素-蛋白复合物LHCⅡ(light-harvesting complexⅡ)的单体、三聚体和寡聚体中叶绿素(Chl)a的电子激发态性质. 稳态光谱结果表明: 选择性激发Chl a或Chl b时, LHCⅡ寡聚体中Chl a的荧光强度减弱并非由Chl b → Chl a传能效率的降低造成, 主要是由聚集体内激发态Chl a的快速猝灭机制引起的. 时间分辨荧光动力学分析表明: 不同聚集态LHCⅡ中Chl a的荧光动力学遵从双指数衰减行为, 长寿命组分(4.1~4.7 ns)来源于LHCⅡ中Chl a的荧光发射; 短寿命组分(135~540 ps)归属为组成聚集体的蛋白单体内Chl a分子间的激发态能量平衡过程, 该能量平衡过程的时间尺度因LHCⅡ的聚集程度不同而异, 在寡聚体(135 ps)中比在单体(540 ps)和三聚体(520 ps)中的平衡显著加快. 上述结果表明, LHCⅡ的三聚体向PSⅡ反应中心传能的本领最强, 而寡聚体则具有较强的猝灭LHCⅡ内Chl a电子激发态的能力, 这可能是一种通过LHCⅡ分子结构的转换来实现光保护功能的机制.     

κ改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α 诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用

在延缓性免疫排斥反应(DXR)过程中, NF-κB发挥着关键作用. 如何恰到好处地抑制其活性是本领域研究的重要问题之一. 用改造的E1A基因(E1AΔ)包括功能区(1 ~ 80氨基酸)和核定位区(139 ~ 243氨基酸), 删除其中可能对人体有害的CR2区, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中, 并转染猪血管内皮细胞(PAEC), 经G418筛选, 获得稳定表达细胞株. RT-PCR技术和细胞生长曲线分析, 证明E1AΔ基因能在PAEC中稳定表达, 且不影响细胞的正常生长, 并能抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α )诱导的细胞凋亡. 报告基因分析表明, E1AΔ能抑制由TNF-α 诱导的NF-κB活性, 其抑制率为53%, 对NF-κB信号转导途径下游的一个重要炎症基因——E-选择素基因的表达抑制率达63%. 综上, E1AΔ基因的这些功能基本符合异种器官移植中克服DXR的要求, 为利用E1AΔ基因克服DXR的可行性提供了实验依据.     

中温纤维分解真菌尖镰孢Fusarium oxysporum的一种新的耐热内切葡聚糖酶

Fusarium oxysporum L19是一株典型的中温真菌, 从其培养液中分离到一种新的耐热内切葡聚糖酶(EGt). 用传统的酶动力学方法, 以CMC-Na为底物, 30分钟的反应时间确定其最适反应温度为75℃; 热稳定性指数衰减拟合曲线显示70℃半衰期为15.1分钟; 该酶不作用于对硝基苯纤维二糖苷(pNPC）. EGt对大多数金属离子及化学试剂不敏感, N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）的蛋白质侧链修饰表明, Trp处于其活性中心. N-末端氨基酸序列为SYRVPAANGFPNPDASQEKQ, 基因测序以及广范的序列比对分析显示, EGt与已知的内切葡聚糖酶没有同源性. 这是首次从中温真菌Fusarium oxysporum中分离到耐热纤维素酶, 多种同工酶的表达可能有助于其适应复杂的生存环境.     

棕色固氮菌nifE缺失突变株(DJ35)钼铁蛋白的特性

从棕色固氮菌缺失nifE的突变株DJ35中纯化得到纯度约为80%的MoFe蛋白(ΔnifE Av1). 与野生种OP中纯化出的MoFe蛋白(OP Av1)相比, ΔnifE Av1具有与之相同的亚基组成, 并可与OP Av1的抗体发生免疫交叉反应, 但在厌氧天然电泳中的迁移率略大于OP Av1. 金属含量测定表明, ΔnifE Av1的Mo和Fe含量均显著下降. ΔnifE Av1单独与OP Fe蛋白互补时不具乙炔还原活性, 但可被从OP Av1中抽提出的FeMo-co体外激活. ΔnifE Av1的圆二色谱450 nm附近区域与OP Av1的相似, 而电子顺磁共振谱中g ≈ 3.7的信号则完全消失, g ≈ 4.3和2.0处的信号也分别下降75%和50%左右. 上述结果表明, 从DJ35中纯化出的ΔnifE Av1是一种FeMo-co缺失而P-cluster正常的MoFe蛋白.     

一株分离自新疆天池寡营养环境的糖丝菌(Saccharothrix sp PYX-6)降解芘的特性

从没有被芳烃污染的新疆天池采集的水样中分离得到一株能够以蒽、菲、芘为惟一碳源和能源的菌株, 并编号为PYX-6. 通过对其形态、生理生化特征、细胞壁组分、脂肪酸组成、DNA分子(G + C)摩尔百分含量及16S rDNA 序列同源性比较发现, 菌株PYX-6为Saccharothrix sp. 对菌株PYX-6以芘为惟一碳源生长和底物降解的研究结果表明, 0.005%酵母膏对细胞生长和芘降解具有明显的促进作用, 细胞生长和底物降解的最佳pH和摇床转速分别为pH 6~8和200 r/min, 细胞生长比底物消失稍迟. 对降解过程中间代谢产物进行质谱分析表明, 邻苯二甲酸是芘降解的中间代谢产物, 说明Saccharothrix sp PYX-6 的降解途径不同于过去报道的Mycobacterium sp PYR-1 的降解途径.     

集胞藻PCC 6803中Ⅱ型RNA结合蛋白对于脂肪酸组成的效应

在集胞藻PCC6803中, Ⅱ型RNA结合蛋白基因rbp3在温度下降时仅有轻微上调. 与野生型相比, rbp3突变株中膜脂多不饱和脂肪酸(PUFA)总量显著减少. 但是, PUFA的减少并未达到影响其在低温下生长的程度. 突变株中的脂肪酸脱饱和酶基因desA, desB和desD, 以及在15℃生长所需要的基因ccr-1的mRNA显著减少, 而rbp1 (RNA结合蛋白1)和crhR (RNA解旋酶轻链)的mRNA不受影响. 因而, Rbp3可直接或间接地影响某些基因的mRNA水平.     

荧光显微技术直接观测C60(C(COOH)2)2与活细胞的相互作用

合成分离纯化了对中枢神经系统退化性疾病具有治疗效果的水溶性富勒烯丙二酸衍生物C₆₀ (C(COOH)₂)₂, 利用荧光显微成像技术直接观察它们与活细胞的相互作用. 并利用流式细胞分析技 术, 进一步对其细胞毒性进行了研究. 实验结果发现, 这种碳纳米物质能够直接进入细胞, 主要集中在细胞质中. 不仅如此, C₆₀ (C(COOH)₂)₂还可以将本身不能进入细胞的分子带入细胞中. 研究还发现, 在 1×10^−2~1×10² mg/L浓度范围内, C₆₀(C(COOH)₂)₂无明显细胞毒性. 研究结果表明C₆₀ (C(COOH)₂)₂在药物载带和输运方面可能具有应用前景.     

阴极射线电子激发下Sr5(PO4)3Cl:Eu2+ 蓝色荧光粉的发光研究

Eu²⁺激发的氯磷酸锶荧光粉一直是一种传统的灯用荧光粉, 合成了蓝色荧光粉Sr₅(PO₄)₃Cl:Eu²⁺, 并研究了在电子激发下的发光特性, 此外还对碱土金属Ca²⁺, Ba²⁺等共同掺杂之后对发光性能的影响及原因进行了分析, 当在中-低电压工作下, 对其在不同电流密度的电子束激发下的发光亮度和饱和特性进行了测量.     

食物中Ni2+胁迫对斜纹夜蛾幼虫中肠细胞解毒酶的影响

食物中的Ni²⁺可在斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius幼虫中肠细胞中积累, 并能诱导中肠细胞中解毒蛋白金属硫蛋白(metallothionein, MT)的表达. 本文研究了食物中不同剂量Ni²⁺对S. litura 5龄和6龄幼虫中肠细胞解毒酶羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST)活性的影响. 结果表明, S. litura幼虫连续3代取食含不同剂量Ni²⁺的食物后, 5龄幼虫中肠细胞内的CarE活性均在低剂量Ni²⁺(≤5 mg/kg)胁迫下低于对照, 在高剂量Ni²⁺(≥10 mg/kg)胁迫下高于对照. 第1代6龄幼虫中肠细胞内的CarE活性也表现为低剂量Ni²⁺胁迫抑制而高剂量Ni²⁺胁迫增加的趋势, 但第2和第3代6龄幼虫中肠细胞内的CarE活性均低于对照. 连续3代受不同剂量Ni²⁺胁迫的5龄和6龄幼虫中肠细胞的GST活性均高于对照, 并随饲料中Ni²⁺剂量(1~20 mg/kg)的增加而增加.     

利用NO2的分解在Au(997)表面制备吸附氧原子

利用以同步辐射光为激发光源的高分辨光电子能谱研究了NO₂与Au(997)单晶表面的相互作用. 芯能级和价带光电子发射结果都表明170 K低温条件下, 低暴露量时NO₂在Au(997)表面上发生分解, 形成NO(a)和O(a)的共吸附表面物种. 当样品在300 K退火时, NO(a)发生脱附, 而O(a)依然吸附在Au(997)表面上. 退火温度升至750 K时, 表面上O(a)的信号完全消失. 结果表明, 在超高真空条件下, 利用NO₂的热分解是在Au(997)表面上制备原子氧吸附物种的有效方法.     

磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)氢酶基因功能分析及对细胞生长的影响

探讨了磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)氢代谢与细胞生长、磁小体合成之间的关系. 分别构建了吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株L206和氢酶大亚基基因hyaB与hupL的双缺失突变株B206. 比较了野生型菌株与突变株在摇瓶培养条件下的吸氢量、放氢量、细胞生长曲线和铁的吸收, 并结合电子显微镜观察了细胞内磁小体合成情况. 结果表明, 磁螺菌HupSL为专一性的吸氢酶, HyaAB为专一性的放氢酶; L206在磁小体合成过程中的放氢量相对较高, 其生长速度、铁吸收速度明显快于MSR-1及B206. 推测磁螺菌可通过上述吸氢酶和放氢酶的作用适当调节细胞内还原力的平衡, 促进铁的吸收和磁小体合成.     

Ca2+参与蚕豆保卫细胞中毒蕈碱型受体介导的乙酰胆碱信号转导

动物神经递质乙酰胆碱(ACh)也存在于植物体内, 并发挥多种重要生理功能. 一定浓度的ACh可诱导气孔开放. 以Ca²⁺荧光指示剂Fluo-3AM为探针, 利用激光共聚焦扫描显微镜观察ACh调控气孔运动中保卫细胞胞质Ca²⁺的动态变化. 结果证明, 外加ACh促使保卫细胞胞质Ca²⁺的瞬时增加. 毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)的激活剂毒蕈碱与ACh的作用类似, 也能激活胞质Ca²⁺的瞬时增加; 反之, 毒蕈碱型受体的抑制剂阿托品预处理则抑制ACh诱导的Ca²⁺增加, 这与动物中mAChR的作用机制类似. 用EGTA螯合胞外Ca2+或用钌红阻断液泡Ca²⁺的释放, 结果表明ACh诱导的保卫细胞胞质Ca²⁺增加主要来源于胞内Ca²⁺库的Ca²⁺释放. 研究表明, 经过mAChR介导, Ca²⁺参与保卫细胞响应ACh刺激的信号转导.