大规模动物细胞固定化培养研究进展

基于固定化载体的生物反应器技术是动物细胞固定化培养的主要手段。综述了近年来微载体，微囊化，无载体细胞自絮凝以及膜等固定化技术在动物细胞固定化培养中的应用及其进展。同时对动物细胞固定化培养中的场效应、多腔室和多细胞混合培养体系进行初步的探讨。     

固定化微生物细胞降解苯酚的研究进展

从固定化细胞的微生物选择、细胞固定化载体的选择以及不同因素对固定化细胞降解苯酚效果的影响等方面介绍了固定化细胞技术在降解苯酚中的研究进展,指出了固定化细胞技术在降解苯酚应用中所存在的一些问题,并展望了固定化细胞技术应用于苯酚降解的前景。     

微生物絮凝剂的研究与开发

从土壤及活性污泥等样品中，分离筛选出高稳定性高絮凝性絮凝产生菌5株，制成微生物絮凝剂产品，对乳制品综合废水，再生纸污泥废水，染料废水等进行了絮凝试验，结果表明，废水固液分离去色效果良好，COD去除率达50％－80％，悬浮物，色度和浊度去除率达90％以上。发现了絮凝菌株絮凝性能水平与相关因素之间的规律，并对开发微生物絮凝剂产品的效益与发展潜力进行了预测分析。     

聚乙烯醇固定化细胞生产L—天门冬氨酸的研究

用聚乙烯醇作为主要载体，用共混，复合和加入多种助剂的方法，对固定天门冬氨酸酸的大肠杆菌，研究了固定化细胞的性质及固定化细胞的储存稳定性，探索了固定化细胞间隙和连续发酵生产Ｌ－天门冬氨酸的生产工艺，获得了间隙和连续发酵的生产能力及固定化细胞的半寿期。     

微生物技术在污水处理中的应用

对应用于污水处理的部分微生物新技术进行概述, 即:固定化微生物技术在有毒废水中应用广泛;微生物絮凝技术因其絮凝范围广、活性高、安全无害无污染而易于实现工业化,成为当今世界絮凝剂方向研究的重要课题;生物吸附法主要用于重金属离子的去除;电极生物膜法是一种针对性很强的方法,主要为反硝化菌的生长提供良好的条件。     

有效微生物群固定化的初步研究

采用聚乙烯醇作为有效微生物群固定化载体,海藻酸钠为成型助剂,通过聚乙烯醇-硼酸交联法制备固定化细胞,并探讨了固定化有效微生物群的特性.结果表明聚乙烯醇是有效微生物群固定化的良好载体,聚乙烯醇-硼酸交联法制备的固定化细胞呈球状,大小均匀,具有较好的脱氮生物活性、较好的机械稳定性和抗溶剂酸碱度.     

用海藻酸钠为载体固定化产二氢嘧啶酶菌体细胞的研究

近年来,固定化微生物细胞及其在工业上的普遍应用,越来越引起人们重视。这是因为微生物细胞被某一载体固定化后、显著增加了靶酶的稳定性,有利于固定化细胞对底物的催化转化和连续作用。同时细胞固定化后,增加了酶——细胞膜——细胞壁——载体——底物之间的反应复杂性。因此固定化细胞的催化性质是一个值得探讨的问题。     

聚乙烯醇固定化细胞生产L－天门冬氨酸的研究

用聚乙烯醇作为主要载体，用共混、复合和加入事种助剂的方法，对固定天门冬氨酸酶的大肠杆菌，研究了固定化细胞的性质及固定化细胞的储存稳定性。探索了固定化细胞间隙和连续发酵生产Ｌ－天门冬氨酸的生产工艺．获得了间隙和连续发酵的生产能力及固定化细胞的半寿期．     

微生物絮凝剂产生菌的筛选及其絮凝影响因素

采用常规的细菌分离纯化方法，从活性污泥和农田土壤中筛选到12株微生物絮凝剂产生茵，经复筛得到一株高效絮凝剂产生茵MBFP-7．以高岭土悬浮液为絮凝对象，研究了温度、pH、微生物絮凝剂的投加量和Ca^2 对絮凝活性的影响；探讨了微生物絮凝剂的絮凝机理．     

微生物絮凝剂及其应用

文章阐述了在污水处理中传统化学絮凝剂的缺陷以及微生物絮凝剂的优越性，综述了近几年国内外微生物絮凝剂的研究现状．微生物絮凝剂的种类、絮凝机理及影响因素，分析了微生物絮凝剂的应用概况，针对当前国内微生物絮凝剂研究中存在的问题指出今后的发展趋势。     

人源性14-3-3σ真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人源性14-3-3σ真核表达载体pCMV-Myc-SFN,并观察其在真核细胞中的表达。方法：通过反转录-聚合酶链反应从HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）中获得编码14-3-3σ的cDNA,定向克隆至真核表达载体pCMV-Myc中,经酶切和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内14-3-3σ的表达。结果：构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,将其转染HeLa细胞48h后,蛋白免疫印迹法检测到细胞内14-3-3σ的表达显著增高。结论：成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,为研究14-3-3σ在上皮细胞源性肿瘤中的作用奠定了基础。     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

鸡survivin重组腺病毒载体的构建和体外表达

根据GenBank中鸡survivin cDNA序列,设计引物,从鸡胚组织提取总RNA,利用RT-PCR扩增鸡survivin全长cDNA,经T-A克隆后插入腺病毒穿梭载体、骨架载体,构建腺病毒重组质粒,转染293E4pIX细胞,构建鸡survivin重组腺病毒.T-A克隆的测序结果与GenBank中鸡survivin cDNA完全一致.限制性内切酶分析和PCR表明腺病毒质粒携带survivin基因,Western blot证实重组腺病毒正确表达survivin,survivin基因已被成功重组到腺病毒基因组.     

骨形成发生蛋白对人骨髓间充质干细胞的影响

目的探讨骨形成发生蛋白(BMP)对人骨髓间充质干细胞的影响及调节作用.方法使用含BMP-7基因的PTracer-CMV载体感染人骨髓间充质干细胞(h MSCs),并设未转染组和空载体组,免疫组化法检测BMP-7蛋白表达,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,湿化学法检测碱性磷酸酶合成情况.结果培养48 h后,BMP-7转染组h MSCs增殖速度明显高于未转染组和空载体组,差异具有统计学意义(P0.05);未转染组与空载体组h MSCs增殖速度之间比较差异无统计学意义(P0.05).BMP-7转染组各时间点G_0/G_1期细胞比例均明显低于未转染组和空载体组;S期、G_2/M期的细胞比例均明显高于未转染组和空载体组,上述差异具有统计学意义(P0.05);各时间点未转染组与空载体组G_0/G_1期、S期、G_2/M期细胞比例间差异均无统计学意义(P0.05).BMP-7转染组h MSCs细胞碱性磷酸酶含量明显高于未转染组、空载体组,差异具有统计学意义(P0.05).结论 BMP-7可促进h MSCs体外增殖和向成骨细胞分化,可能与促进细胞由G_1期进入S期、DNA合成增加、提升DNA合成的后期细胞数量有关.     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri的构建及鉴定

构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-c1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础.用亚克隆法,将目的片段egfp-c1-hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上,用酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,用800 mg/L G418筛选2周后,在荧光显微镜下检测其表达.双酶切鉴定得到pLNCX-EGFP-C1-hri阳性克隆,荧光显微镜显示绿色荧光在B16细胞质中高效表达.成功构建逆转录病毒表达载体pLNCX-EGFP-C1-hri.     

肌细胞途径血友病B基因治疗的载体优化研究

构建了含有ＭＣＫ增强子,βａｃｔｕｎ启动子,及ｈＦＩＸ内含子１的３个载体Ｇ１ＮａＭＢＡＩＸ,Ｇ１ＮａＭＢＡｉＩＸ,Ｇ１ＮａＰＡＩＸｉ‘ＢＡＭ。转入ＰＡ３１７和成肌细胞Ｃ２Ｃ１２细胞后测定ｈＦＩＸ的表达,发现反向构建的Ｇ１ＮａＰＡＩＸｉ’ＢＡＭ表达最高且最稳定,而正向构建的Ｇ１ＮａＭＢａＩｉｘ的内含子常被剪切,在Ｃ２Ｃ１２细胞中表达不高。     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

利用pGenesil-1.0构建人Dna2真核表达干扰载体

目的:构建人基因Dna2干扰(RNAi)的真核表达载体.方法:根据GenBank上人Dna2的cDNA序列设计并合成两条单链寡核苷酸,退火以后,插入质粒pGenesil-1.0多克隆位点的BamH I和Hind III之间进行重组,构建重组干扰载体,转化DH5α后测序鉴定出阳性菌株.重组质粒以脂质体法转染HeLa细胞,提取Dna2蛋白以免疫印迹法检验干扰效果.结果:设计的目的干扰序列5’-catagccagtagtattcgatg-3’可明显抑制Dna2在HeLa细胞的表达.结论:利用pGenesil-1.0构建的人Dna2干扰载体适用于该基因功能研究.     

梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞永生化细胞株的构建及鉴定

分离梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞,使用SV40 LT抗原慢病毒载体建立永生化软骨细胞和间充质干细胞系并鉴定。将含有SV40 LT基因片段的慢病毒载体,转染人胚肾细胞293T获得包装后的病毒粒子,感染鹿茸软骨细胞及间充质干细胞,连续传代培养,通过形态观察、细胞增殖、real-time PCR、甲苯胺蓝染色法和流式细胞术等方法检测SV40 LT抗原表达以及细胞性质。实验所建立的永生化鹿茸软骨细胞系与间充质干细胞系能够稳定传代并具有较强的体外增值活性。RT-PCR检测到SV40T抗原的表达,通过甲苯胺蓝染色法和流式细胞术鉴定所得细胞系具有原代细胞的基本性质。成功获得永生化的软骨细胞与间充质干细胞系,为后续鹿茸生长及发育研究奠定了基础。     

磷酸钙法将MMP-2，MMP-3双基因干扰载体转入HEK293T细胞的效率观察

检测用磷酸钙法能否将修饰后用于沉默MMP-2,MMP-3基因的慢病毒载体有效地转入到HEK293T细胞。利用磷酸钙法,MMP-2,MMP-3双基因干扰载体（MMP组）与对照质粒（对照组）被分别转染HEK293T细胞,在转染后的第24,48及72h,通过计算绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞数的百分比来判断转染效率。转染24h后,两组细胞均生长状况良好,荧光显微镜下观察,已有大量绿色荧光出现,计算MMP组转染效率为（91．5±6．2）％,对照组转染效率为（80．3±4．7）％;转染后48—72h,两组感染效率均未见明显下降。与对照相比,插入了MMP-2,MMP-3 shRNA模板序列的慢病毒载体没有降低磷酸钙法转染HEK293T细胞效率,反而有所增高。