翘嘴鳜肝肾坏死症病原菌的分离及初步鉴定

从主要呈现肝肾坏死症的翘嘴鳜病灶部位分离到９个菌株,其中３个菌株能通过人工感染在正常翘嘴鳜上复制出与自然发病相同的症状。用直接荧光抗体法对致病菌株的鉴定结果表明,本研究中分离的３个菌株均不同于过去从患病翘嘴鳜上已经分离到的柱状嗜纤维菌（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）和嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）。     

翘嘴鳜的人工繁殖与胚胎发育观察

采用不同配伍外源激素对性成熟翘嘴鳜催情,发现:20～24°C下,催产素PG+LRH-A+HCG的效应时间更短;25～29°C下,则催产素PG+HCG效应时间更短。采用人工受精的方法获得受精卵,在水温18～22°C观察翘嘴鳜胚胎发育的时序和特点,从受精卵发育到破膜仔鱼经过了68h17min;翘嘴鳜胚胎发育可分为7个阶段26个时期。文章还详细记录了翘嘴鳜胚胎发育各个阶段的形态特征。     

翘嘴鳜口服免疫效果的初步观察

将翘嘴鳜“肝肾坏死症”病原菌经福尔马林灭活的菌苗注射饵料鱼后,投喂翘嘴鳜,连续１４ｄ。于投喂结束２１ｄ后,通过检测受免鱼和对照鱼血清,体表和肠粘液中凝集抗体效价和血液中白细胞的吞噬活性,证实了口服免疫接种能使翘嘴鳜产生特异性免疫应答。     

翘嘴鳜淀粉酶基因SNPs和微卫星位点多态性的检测

本研究主要检测翘嘴鳜淀粉酶(amylase,AMY)基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和微卫星位点多态性.实验采用PCR产物直接测序法(PCR-direct sequencing,PCR-DS)检测翘嘴鳜AMY基因组序列的SNPs和微卫星位点,并使用创造限制酶切位点PCR法(created restriction sites PCR,CRS-PCR)和PCR-DS法对SNPs进行分型,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测AMY基因微卫星位点的多态性.实验结果发现AMY基因第1内含子有一个SNP位点A1,第5内含子有3个SNPs位点(A2、A3和A4);此外,第5内含子中还存在一个微卫星位点B1,共检测到4个等位基因,有9种单倍型.在翘嘴鳜群体中,4个SNP位点呈中度遗传多样性,而微卫星位点表现出高度遗传多样性.     

翘嘴鳜线粒体基因组全序列的克隆与特征分析

通过直接测序的方法获得翘嘴鳜线粒体DNA基因组全序列(GenBank:JF972568).翘嘴鳜线粒体基因组全长为16 496 bp,其包含13个编码蛋白基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个Control region区域.整个翘嘴鳜线粒体DNA利用率非常高,仅仅只有32 bp的基因间隔和35 bp的基因重...     

翘嘴鳜髓过氧化物酶基因克隆及重链序列的原核表达

利用RT PCR和RACE PCR方法,从翘嘴鳜中克隆出髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）cDNA全长。其开放阅读框有2?292个核苷酸,编码763个氨基酸的蛋白。虽然序列相似性分析发现该蛋白与哺乳动物MPO相似性为64%～65%,但分子质量大小相近。翘嘴鳜含有1个与人MPO相似的血红素基,1个保守的Ca2+结合位点,6个分子内二硫键,以及6个糖基化位点。由此推测翘嘴鳜MPO蛋白的空间结构及催化机制可能与哺乳动物的相似。将翘嘴鳜MPO的部分DNA序列连接到pET 32a c(+)载体上,成功构建了1个重组表达质粒pET MPO,该质粒在大肠杆菌（DE3）中获得了高效表达。另外,利用重组蛋白N末端带有的6×His标签,通过Ni2 NTA柱纯化获得了翘嘴鳜MPO重组蛋白。     

翘嘴鳜EST-SSR标记的开发及3个群体遗传多态性分析

为保护野生翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)的种质资源以及遗传育种,本研究从翘嘴鳜的EST文库中开发微卫星并筛选出22对具有多态性的微卫星标记,对来自陆水水库(赤壁)和沅江流域(常德、怀化)的3个野生群体进行了遗传多样性分析.实验结果显示,这些标记在3个群体中均表现出了丰富的多态性;共检测到134个等位基因;各基因座观测等位基因数4～8个;平均等位基因数为6.090 1;观测杂合度0.675 4;期望杂合度0.748 7;多态信息含量0.701 0,表明3个翘嘴鳜群体在各检测位点中具有较好多态性.对数据进行F-检测,平均Fst值为0.038 3,说明群体间的遗传分化程度低;而群体遗传相似度和遗传距离的计算结果显示:常德和怀化群体的遗传相似度最大,遗传距离最小;而常德与赤壁群体的遗传相似度最小,遗传距离最大.这恰恰与翘嘴鳜群体的流域分布一致.     

翘嘴红鮊胚胎发育研究

采用连续观察法研究翘嘴红鲌(Culter alburnus Basilewsky)人工授精的去膜受精卵的发育.结果显示,翘嘴红鲌胚胎发育可分为受精卵、胚盘形成、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、胚孔封闭期、眼基和眼囊出现期、尾芽至肌肉效应期、心脏原基期至心脏博动期、出膜前期共11个时期.受精卵呈灰黄或青灰色,直径0.8mm左右,吸水后直径可达1.2mm左右,在水温27℃条件下,受精卵历时1560min孵化,积温702℃·h;初孵仔鱼全长2.3mm左右.     

翘嘴红鲔繁殖技术研究

通过试验研究了翘嘴红铂亲鱼培育、人工催产、受精卵孵化的技术。结果表明：天然水域捕捞的翘嘴红铂鱼种在池塘条件下，通过人工培育能够达到性成熟，其成熟系数为14．46，相对繁殖力为30．28。亲鱼采用一次性注射组合催产剂，自然产卵的方式，受精卵在孵化环道中完成胚胎发育孵化出苗，LRH-A2 1．2μg＋DOM5mg和LRH-A21.2μg＋HCG 1000 IU＋PG 0．8mg催产剂组合具有较高的催产率和受精率。     

翘嘴红鮊胚胎发育研究

采用连续观察法研究翘嘴红鮊(CulteralburnusBasilewsky)人工授精的去膜受精卵的发育。结果显示,翘嘴红鮊胚胎发育可分为受精卵、胚盘形成、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、胚孔封闭期、眼基和眼囊出现期、尾芽至肌肉效应期、心脏原基期至心脏博动期、出膜前期共11个时期。受精卵呈灰黄或青灰色,直径0.8mm左右,吸水后直径可达1.2mm左右,在水温27℃条件下,受精卵历时1560min孵化,积温702℃·h;初孵仔鱼全长2.3mm左右。     

鳜暴发流行病病毒性病原研究

患病鳜肾脏、脾脏、肝脏、心脏、鳃中发现二十面体病毒粒子,肾脏和脾脏是其感染主要器官．成熟病毒粒子直径１５０ｎｍ,核心球状,直径１０５ｎｍ．受感染细胞肿大,直径为正常细胞３～４倍,细胞核萎缩,为正常细胞核直径１／３．病毒粒子部分纯化后,经腹腔人工感染,第７天开始死亡,１０ｄ内死亡率为１００％,表现与池塘养殖状态相同症状,并在人工感染鳜肾和脾中电镜观察发现大量相同病毒粒子,命名为传染性脾肾坏死病毒（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｓｐｌｅｅｎａｎｄｋｉｄｎｅｙｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,ＩＳＫＮＶ）．     

鳜传染性脾肾坏死病毒ICR489基因序列分析

报道了鳜鱼传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV)的ICR489基因结构及其序列分析。对ISKNVDNAKpnⅠB酶切片段的序列分析结果发现该序列中含有完整的ICR489基因。ISKNVICR489基因完整读码框为 10 11bp ,GC含量为 5 6 97% ,等电点为 6 82 ,编码一个长为 337aa、相对分子质量为 382 70的推定蛋白。结构分析发现该基因起始密码子上游具有启动子元件TATAbox,有反向重复序列可形成茎环 ,并有一段回文序列。ISKNV与其它 3种虹彩病毒 (FV3、RRV和LCDV_1)的ICR489基因氨基酸序列具有一定的同源性 ,但ISKNV与它们的同源性不高 ,序列比较和系统树分析发现ISKNV与蛙病毒属和淋巴囊肿病毒属的病毒都不尽相同     

鳜鱼基因组(AC)n微卫星富集文库的构建与鉴定

鳜鱼基因组DNA经MseI酶切后,与MseI接头连接,用链霉素和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)8杂交,杂交复合物通过变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T 载体上,转化至大肠杆菌DH5α中,首次成功构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组(AC)n重复类型的微卫星富集文库.测序结果表明,阳性克隆率为60%,说明构建的鳜鱼基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库.鳜鱼富集微卫星文库的建立将为下一步进行鳜鱼微卫星标记的筛选提供了有效的工具.     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

鳜鱼和鲢鱼不同组织微管蛋白表达差异分析研究

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Western-blotting和酶联免疫反应技术(ELISA),对三种微管蛋白(α,β,γ-tubulin)在鳜、鲢两种鱼的脑、心、脾、肾四种组织中的表达差异进行了比较.实验表明:鳜鱼α-tubulin的表达在心、脑、脾、肾中逐渐减弱;β-tubulin含量的递减顺序为脑、心、肾、脾;而脾、肾、脑、心中γ-tubulin的表达量依次减小.鲢鱼中三种微管蛋白的表达依次为:肾、脑、心、脾(α-tubulin);肾、脾、心、脑(β-tubulin),肾、脾、脑、心(γ-tubulin).两种鱼之间不同组织中的三种微管蛋白在量上的差异也较为明显.研究结果说明微管蛋白的表达具有明显的种属和组织差异性,这种差异性可能与其组织功能相关.     

甘薯开花规律的观察

对甘薯的开花规律作了观察．结果表明,一个植株的花序有30－75个,开花顺序有先后．在一个植株上,花是从下而上开放的;在一个花序上,花由内向外开放,它的开花情况符合两种模式图．从每一个植株纵向开花来看,花是从下而上呈螺旋报开放．     

锯缘青蟹肌肉组织坏死的病理研究

针对福建省龙海县土池人工养殖的锯缘青蟹发生肌肉浊白现象，开展肌肉组织病理学研究，发现病蟹的肌纤维断裂、肌细胞坏死溶解、细胞核萎缩和空泡变性、在肌肉组织中存在大量的20面体、大小约为150nm的球形病毒粒子，初步推断该病毒为锯缘青蟹肌肉坏死症的病原体。