胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆及其在E.coli中的表达

对中国的一个胡萝卜品种进行了冷诱导前后幼苗总蛋白组成的比较、分析 ,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明两者在相对分子质量 36 0 0 0附近有一条蛋白带的差别。由此推测实验的胡萝卜品种在冷诱导过程中有抗冻蛋白 (AFP)表达。根据相关的研究结果设计引物 ,以胡萝卜幼苗基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增得到了长 10 99bp的抗冻蛋白基因。测序结果表明其与GenBank公布的afp序列仅有 3个碱基的差别。将此抗冻蛋白基因克隆进大肠杆菌表达载体pGEX4T1,在IPTG的诱导下表达出了含有AFP的约 6 0 0 0 0的融合蛋白 ,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化

谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类，为了进一步研究其功能，我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物，进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因(NADP-specific glutamate dehydrogenase，gdhA gene)，将所得DNA片断连接到质粒pUC18上，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选和酶切鉴定，经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和双波长扫描分析，确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在，未能检测到可溶性蛋白的表达，表达量可达菌体总蛋白的15％以上．     

人类抗砷相关基因hARRG全长cDNA的克隆和在E.coli中表达

通过对构建的人胎脑cDNA文库进行大规模测序,发现一条人类新基因,序列与仓鼠asr2序列高度同源,达88％,命名为人类抗砷相关基因（human arsenic resistance related gene.hARRG),hARRG与抗砷基因相关序列ARS2（AF082871）几乎完全全同源,仅比它短253bp,hARRG并不是全长基因而仅是一个cDNA片段,为了获得hARRG全长cDNA,运用Northern blot电子RACE和5－SMART－RACE的方法克隆了一条2999bp 的hARRG全长cDNA,通过Unigene染色体定位于7q21.3,经过生物信息学分析发现,该cDNA有完整的读码框,编码一个788个氨基酸的蛋白,预计分子质量为89．2ku,并在大肠杆菌中获得了成功表达。     

黄杆菌（Flavobacterium sp.）ATCC27551 opd基因在E.coli中的克隆及表达

研究了黄杆菌ATCC27551的opd基因在大肠杆菌中的表达,并对于表达产物进行了胞内定位和酶活测定,通过PCR扩增和PCR产物直接克隆,将黄杆菌质粒上的一段长达1137bp和opd基因进行扩增及克隆,然后按正确的读码框亚克隆于表达载体pET28b（ ）上,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导,获得了较高量的基因表达产物,该表达产物以包涵体的形式存在于细胞内,通过分离包涵体可以得到电泳较纯的条带,工程菌的细胞活性达到原始菌株黄杆菌的水平。     

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coli BL21(DE3)plysS中的表达

用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E．coli BL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS—PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33．4kD,约占菌体总蛋白29．4％．     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。     

人补体调节蛋白基因MCP和DAF的克隆及其在E. coli中的表达

人膜辅基蛋白MCP(membrane cofactor protein)和降解加速因子DAF(decay-accelerating factor)是免疫排斥反应中补体系统活性调节的重要蛋白．以PCR的方法分别从成人肝cDNA文库和胎儿骨髓cDNA文库中扩增得到MCP和DAF基因，克隆入载体pUC19，再以所构建质粒为模板，以PCR的方式在二基因间加入编码柔性连接肽的DNA序列，构建融合基因MCP-DAF，并克隆入pUCl9质粒．将MCP、DAF及MCP-DAF亚克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a( )或pET-32b( )，构建表达载体MCP-pET32a，DAF-pET32b及MCP-DAF-pET32a，分别导入E．coli BL21菌株中表达，得到预期分子质量大小的蛋白．     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因，与质粒PBV220连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达，用SDS－PAGE电泳鉴定，在38kD处有一条明显的带，占菌体蛋白的20％左右，同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

小鼠OB基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织中扩增了OB基因,并利用定向克隆技术克隆至原核表达载体pTO-T7.将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot检测.表达产物利用亲和层析技术进行纯化.结果显示:表达的带有his标签的小鼠leptin融合蛋白,分子量约为20 ku.0.5 mmol/L的IPTG在37℃诱导2.5 h时,leptin融合蛋白的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上.表达产物经过纯化,纯度可达90%以上.Western-blot杂交显示,小鼠leptin融合蛋白有很强的抗原特异性.     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

血管内皮抑素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

血管内皮抑素不仅能特异性地抑制血管内皮生长，而且对血管形成和肿瘤生长也具有强烈的抑制作用。利用PCR法从人胎肝cDNA文库中克隆了人血管内皮抑素的编码序列，构建了重组质粒pRSendo，并在E.coli中表达，SDS－PAGE表明其表达产物为包涵体，此外，还对血管内皮抑素做了初步的纯化。     

人血管抑素AK(1-3)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用6月龄大月份流产的新鲜肝脏组织为材料,提取总RNA,通过反转录得到cDNA,并以此为模板,经PCR得到人Angiostatin基因的AK(1-3)片段.将此PCR产物直接与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α.经蓝白菌落筛选,PCR和酶切检测,筛选出阳性克隆,命名为pMDA,测序证明克隆序列与GenBank发表序列一致,大小为858bp.用Sal 和Bgl 酶切将该基因插入载体pQE40,并转化宿主菌M15[pREP4].经质粒电泳PCR和酶切检测筛选阳性克隆,得到表达载体pQEA,插入基因与载体上小鼠DHFR基因重组形成嵌合基因.在30℃,2×YT培养基(Kan25μg/mL Amp200μg/mL),2mmol/LIPTG条件下诱导pQEA/M15[pREP4]表达.所得菌体总蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明,在预期的61kD处得到一条特异带,为AK(1-3)cDNA与载体固有基因DHFR-6хHis的重组蛋白表达产物.实验结果为抗肿瘤药物的研制提供了条件.     

不同基因型的人类乙醛脱氢酶2基因的克隆及表达

乙醛脱氢酶2是细胞防御系统的重要组成部分,它催化各种对人体有害的醛类成相应的酸．实验证明,东亚人群中存在大量的突变基因型aldh2*2,且aldh2*2基因型与酒后宿醉程度(脸红及不适感)相关．本实验采用昆虫细胞表达系统sf9高效表达ALDH2和ALDH2*2,并分别检测两种蛋白对底物乙醛的催化活性,发现二者对乙醛的催化活性差异显著,其中ALDH2的Km为1．70μmol／L,而ALDH2*2的Km为61．56μmol／L,支持了前人关于ALDH2的遗传缺陷可能导致醉酒及酒后不适感的结论．