铁蛋白重链多肽对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响

为了探讨铁蛋白重链多肽(ferritin heavy chain 1,FTH1)对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响,采用RNA干扰和实时定量方法进行研究,首先提取RAW264.7细胞的总RNA,应用反转录PCR获得定量片段,制定标准曲线。将pSIREN-FTH1A/B转染到RAW264.7细胞,48 h后用绵羊种布鲁氏菌019株侵染4 h,实时定量PCR检测凋亡相关基因Mkl1、Birclb的表达,GAPDH作为内参基因,检测干扰前后凋亡相关基因mRNA的量。结果显示:转染pSIREN-FTH1的细胞被布鲁氏菌侵染后,Mkl1、Birclb基因mRNA的量较干扰前分别降低了76.3%、88.8%。FTH1可调节凋亡相关基因表达从而影响细胞凋亡的进程。     

绵羊布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞的荧光表征与分析

通过对绿色荧光蛋白(GFP)布鲁氏菌16M(强毒株)和M5(弱毒株)侵染小鼠巨噬细胞及胞内溶酶体、内质网、高尔基体初次结合所用时间进行测定,探讨二者在结合所用时间上是否存在差异;其次比较GFP布鲁氏菌16M和M5与胞内各细胞器结合产生的荧光强度。将GFP布鲁氏菌16M(强毒株)和M5(弱毒株)分不同时间段分别侵染RAW 264.7(细菌和细胞比例为100︰1),利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察和检测。结果表明:布鲁氏菌16M和M5侵染初期10 min时进入巨噬细胞,1.5 h时布鲁氏菌到达溶酶体,2.0 h时布鲁氏菌到达内质网和高尔基体。结果提示,布鲁氏菌16M和M5在侵染进入宿主细胞与胞内各细胞器初次结合所用时间相同,但布鲁氏菌16M与各细胞器结合的荧光强度均高于布鲁氏菌M5。以此推断布鲁氏菌16M进入胞内的数量高于布鲁氏菌M5。     

FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用

为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BMEI1135基因缺失株的构建及鉴定

为了初步探讨BMEI1135基因在布鲁氏菌感染过程中的作用,以16M为模板利用同源重组和抗性替换的方法,构建羊种布鲁氏菌16M(简称16M)BMEI1135基因缺失株(16M△BMEI1135)。将亲本株16M、疫苗株M5-90、缺失株16M△BMEI1135在相同起始浓度下震荡培养,观察其生长变化趋势;将各菌株置于强酸、强碱、高盐、热休克应激条件下,观察其生存率;侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,比较其在胞内的生存能力,并在不同时间点收集细胞提取RNA,通过qRT-PCR检测自噬相关基因的表达。研究结果显示:成功获得了布鲁氏菌BMEI1135基因缺失株且20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16M△BMEI1135在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株体在外界应激条件下生存能力低于亲本株;胞内CFU显示侵染4 h后缺失株胞内细菌数量明显下降(P0.01);qRT-PCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P0.01)。本实验的研究结果表明:布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M的胞内生存介导的细胞自噬密切相关,该研究为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。     

NLRP3炎症小体在牛种布鲁氏菌2308和RB51侵染人巨噬细胞THP-1过程中作用的初步研究

为了探索NLRP3炎症小体在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中的作用,以牛种布鲁氏菌强毒株2308、弱毒株RB51侵染人巨噬细胞THP-1,用实时荧光定量PCR方法探索布鲁氏菌引起宿主细胞中NLRP3炎症小体及相关细胞因子的变化情况。结果表明:在布鲁氏菌侵染THP-1细胞后0-24 h,NLRP3炎症小体在转录水平上总体呈现先下降后上升的趋势,THP-1细胞形态随着侵染时间的延长变得不规则,且出现聚集现象。强毒株2308对NLRP3炎症小体相关基因转录水平和THP-1细胞形态变化的影响均强于弱毒株RB51。这表明布鲁氏菌在感染初期有短暂抑制炎症小体的能力,这可能是布鲁氏菌逃避巨噬细胞杀灭作用的一种策略。     

牛种布鲁氏菌2308参考株Δ VceC基因缺失株的构建与鉴定

为了研究布鲁氏菌四型分泌系统VceC蛋白的功能,构建牛种布鲁氏菌2308参考株△vceC的基因突变株,本研究以牛种布鲁氏菌参考株2308的分泌蛋白VceC为研究对象,以牛种布鲁氏菌参考株基因组为模板,高保真(pfu酶)扩增VceC基因的上下游同源臂基因;以卡那抗性基因质粒为模板高保真扩增卡那抗性基因,运用融合PCR将上下游同源臂和卡那抗性基因融合,用TA克隆的方法将融合片段连接到克隆载体上,再用电转化的方法将载体转入布鲁氏菌2308感受态细胞中,最后用卡那抗性筛选并检测其遗传稳定性。将亲本株2308缺失株2308△VceC在相同起始浓度下震荡培养,观察其生长变化趋势;侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8),比较其在胞内的生存能力。结果显示:利用T载体克隆和抗性替换的方法成功构建了2308的VceC的突变株,与亲本株相比,2308△VceC在体外培养生长趋势与亲本株相似,在12 h时进入对数生长期,30 h时进入平台期,胞内CFU显示侵染12 h后缺失株胞内细菌数量明显下降,亲本株2308和2308-Δ VceC缺失突变株在12 h时差异显著。本研究为布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统的功能研究奠定了基础。     

布鲁氏菌043强毒株BR0524基因缺失突变株的构建与毒力的初步评价

为研究BR0524基因对羊种布鲁氏菌043毒力的影响,本研究利用同源重组的原理,以BR0524基因外侧的同源臂序列构建重组质粒,将其电转化至布鲁氏菌043感受态细胞,通过卡那抗性筛选和检测引物鉴定之后进而获得羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株,且该缺失突变株在15代内未发生回复性突变,遗传性稳定。将羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株、羊种布鲁氏菌043和M5以106 CFU剂量腹腔接种小鼠,进行体内感染试验,并以布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞为100∶1的感染比例侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7。结果表明:与羊种布鲁氏菌043相比,羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株的载菌量几乎没有下降(P0.05),对小鼠脾脏重量变化的影响也趋于相似(P0.05);侵染小鼠巨噬细胞试验结果与动物感染试验结果也趋于一致(P0.05),这表明BR0524基因的缺失不会对羊种布鲁氏菌043毒力功能的发挥产生显著的影响。     

布鲁氏菌感染诱发巨噬细胞炎症反应的初步研究

为研究NLRP3炎症小体在布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞过程中活化介导的炎症反应,建立牛种布鲁氏菌2308株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,侵染比例100∶1(细菌∶细胞),RT-PCR技术检测细菌侵染过程中NLRP3炎症小体相关分子NLRP3和Caspase-1 m RNA的变化水平;Western blot分析NLRP3和Caspase-1在蛋白水平的变化;ELISA检测感染细胞上清中炎症因子IL-18和IL-1β的释放量。结果表明:与对照组相比布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞后NLRP3和Caspase-1 m RNA和蛋白表达水平显著增加(P0.05),炎性因子IL-1β和IL-18的含量也显著升高(P0.05)。结论:布鲁氏菌感染可激活NLRP3炎症小体,为进一步研究布鲁氏菌感染引发致病机制奠定理论基础。     

海分枝杆菌embA低表达菌株的构建及巨噬细胞侵染实验

通过CRISPRi基因编辑技术构建阿拉伯糖基转移酶基因A(embA)低表达海分枝杆菌突变株,利用qRT-PCR技术检测相关基因转录水平。突变株侵染巨噬细胞后,台盼蓝染色测定细胞存活率,稀释涂布法检测胞内活菌数量。免疫荧光染色观察感染后巨噬细胞中F-actin细胞骨架重排和吞噬小泡的形成。分别通过Western blot和细胞因子悬液芯片方法验证小鼠巨噬细胞J774A.1胞内髓样分化因子88(Myeloid Differenti-ation factor, MyD88)表达量和细胞因子分泌。结果显示：对数生长中期野生型海分枝杆菌中glfT2和embA基因表达量增加。embA低表达突变株中embB,glfT2等6个阿拉伯半乳聚糖合成基因显著下调,但菌体形态和长度不变。与对照菌株相比,突变株侵染J774A.1巨噬细胞24 h后,细胞存活率和胞内CFU上升,吞噬小泡和骨架蛋白无明显变化。胞内MyD88蛋白表达水平增加,分泌性炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子RANTES、MIP-1α水平上升。本研究提示,embA表达量下降会降低海分枝杆菌的细胞毒力,但不会直接改变巨噬细胞吞噬病原菌的生理过...     

布鲁菌DK63426基因缺失株的构建及生物学特性研究

目的本研究构建了羊布鲁菌16M DK63_426基因缺失株,分析其在细胞内的生存繁殖和致炎能力。方法以羊布鲁菌16M株基因组为模板,利用融合PCR技术将DK63_426基因的上下游同源臂和卡那抗性基因融合,连接到克隆载体上,通过基因重组构建布鲁菌16M DK63_426基因缺失株16MΔDK63_426,观察布鲁菌亲本株16M和16MΔDK63_426的生长变化趋势,建立侵染小鼠巨噬细胞RAW264. 7模型,检测亲本株和缺失株16MΔDK63_426在胞内的生存能力,检测IL-6、TNF-α细胞因子释放量。结果成功构建了16MΔDK63_426;在体外相同培养条件下该缺失株与亲本株生长趋势相似,培养12 h即进入对数生长期,30 h进入平台期; 16MΔDK63_426在浸染RAW264. 7细胞12 h胞内存活率极显著低于亲本株(P0. 01),在浸染8 h时IL-6的分泌量缺失株组均显著低于亲本株(P0. 05),TNF-α的分泌量缺失株组均显著高于亲本株(P0. 05),在侵染12 h时IL-6的分泌量缺失株组均极显著低于亲本株(P0. 01),TNF-α的分泌量缺失株组均极显著高于亲本株(P0. 01)。结论 DK63_426基因的缺失可影响布鲁菌的胞内存活,影响相关炎症因子的表达,为布鲁菌感染机制的研究奠定理论基础。     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

关于一维非自治时滞系统点态退化一例

给出了一维非自治时滞系统点态退化的一个例子,拓宽了该领域的研究。     

十二烷基苯硝化选择性的测定

利用对位异构体的对称性由核磁共振氢谱测定了工业十二烷基苯在硝硫混酸中的硝化选择性，发现一硝化产物中对位异构体的比例为７５％￣８０％。以月桂酸和苯为原料，经氯化、酰化和还原合成了正十二烷基苯。在同样条件下研究了正十二烷基苯的硝化，由核磁共振氢谱和气相色谱分析，发现一硝化产物中对位异构体的比例仅为６０％。根据空间位阻效应，对结果进行了讨论，并与甲苯，乙苯，异丙苯等短链烷基苯的硝化结果进行了比较。     

YBCO掺杂效应研究

介绍了YBCO掺杂的基础知识,总结了YBCO各个位置采用典型元素掺杂而导致的超导电性和结构的变化,阐述了掺杂对YBCO的重要影响,并简介了当前YBCO掺杂效应研究中的几个热点问题.     

A_5的一类12阶子群的构造

由于有限群的Lagrange定理的逆不成立,因此,n较大时要确定n次交代群An的所有子群或对An阶数的每一个正因数,确定是否存在这个阶数的子群是较困难的问题.文章通过对5-循环置换各次方幂的计算及其研究,构造出了A5的5个12阶子集,并证明了每一个子集都是A5的12阶子群,最后对A5的部分阶的子群做了总结.     

高频机组基础振动检测分析

为了找出诱发高频机组基础不良振动的原因，从基础计算模型方面对基础激励与响应进行了分析，以两个高频机组基础为动测实例，经模态分析得出钢筋混凝土构架式基础竖向1阶振动与电机产生共振；应用功率谱法对动力机组及基础平台进行动测，得出平台异常响应频率66Hz为水泵工作频率，调整机器的工作频率可避开不良振源影响，达到明显的减振效果。由此而知，动力机器基础出现不良振动时，不可盲目改变结构的动力特性，应在机器不同工况比如：停机、起机及正常转速下，对机器及基础进行动测并对振动信号进行比较分析，以制定出行之有效的减振方法。     

“真空的真空”的存在性问题

许多科学家包括诺贝尔奖获得者李政道教授都预言,真空是未来物理学的一个重要研究对象.十七世纪的伽利略时代人们曾讨论过"真空"是否存在的问题.当时的学术界分成两派,一派以帕斯卡为代表,认为真空存在,另一派以笛卡尔为代表,认为真空不存在,最后实验证明"真空存在派"正确.现代研究表明,真空并非一无所有,这样就产生了一个新的问题"排除了真空物质后的空间",即"真空的真空"是否存在.本文探讨了与"真真空"有关的问题,提出了一些观测实验方法,这些方法可以帮助我们最终解答"真真空"的存在性问题.     

圈幂补图的树宽

基于“前沿分支”的观点研究了圈幂补图的树宽，首先确定了它的树宽下界，又给出了达到此下界的标号，从而得到了它的树宽表达式。