罗非鱼鱼鳞胶原多肽的优化制备及其生物活性研究

以罗非鱼鱼鳞为原料,采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合水解,在单因素试验的基础上,采用响应面法优化酶解工艺,制备鱼鳞胶原多肽.测定胶原多肽的抗氧化活性、细菌低温保护活性、氨基酸组成及相对分子质量分布.结果显示,最适酶解条件为:底物质量浓度30.6 mg·m L-1、胰蛋白酶和碱性蛋白的加酶量分别为1.44和0.70 mg·m L-1、酶解温度50℃、pH值8.5、酶解时间6.35 h.酶解胶原多肽对DPPH自由基和羟基自由基的半数清除质量浓度(IC50)分别为2.89和3.54 mg·m L-1.经过细菌低温保护试验,当胶原多肽质量浓度为1 mg·m L-1时,嗜热链球菌的存活率达到75.6%.鱼鳞胶原肽相对分子质量分布显示,78%多肽片段的相对分子质量分布于180~2 000 u之间.氨基酸组成分析显示鱼鳞多肽富含甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸及天冬氨酸等,这些特定的氨基酸与胶原多肽的抗氧化活性、细菌低温保护活性相关.     

EDC/NHS交联对胶原物理化学性能的影响

为了提高胶原的物理化学性能,采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂对胶原进行交联,考察了不同交联剂浓度对胶原物理化学性能的影响,并通过红外、差示扫描量热分析(DSC)、吸水率、膨胀动力学、抗酶解性能、扫描电镜(SEM)等技术手段对胶原交联前后的性能进行表征.研究结果表明,胶原经EDC/NHS交联后,热稳定性、形态稳定性增强,抵抗酶解的能力显著增加,胶原的显微结构由交联前的无序状态变为紧密有序的结构.说明EDC/NHS交联可有效改善胶原的物理化学性能.     

胶原支架材料的制备与表征

分别采用真空高温脱水和化学交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺处理经冷冻干燥后的胶原海绵材料,制备组织工程支架,讨论反应条件对胶原性能的影响,测定胶原支架的力学强度和降解特性.结果发现,不同的处理方法都能保持胶原海绵的三维多孔结构,孔隙率可达到90%;真空高温脱水获得的胶原海绵材料力学强度较小,但断裂伸长率略大;碳化二亚胺交联胶原海绵材料力学强度相对较高,抗张强度为380 kPa左右.胶原海绵交联后,降解速率显著小于未经交联的胶原材料.细胞培养试验表明成纤维细胞可以在支架材料上正常生长.两种交联方法处理胶原海绵,其细胞生长行为差异无显著性,适合于作为组织工程支架.     

酸解提取胶原的研究

以新鲜猪皮为原料,采用有机溶剂无水乙醇、异丙醇两部法除去碎猪皮液的脂肪,再用二氯甲烷抽提,完全去除碎猪皮液中的脂肪,然后用盐酸水解的方法提取胶原.在单因素实验的基础上,通过正交实验确定胶原蛋白提取的最佳条件为超声时间2h、盐酸的浓度10%、温度30℃、液比1∶3.5,在此条件下的胶原纯度达95.45%.红外光谱测试显示,胶原蛋白具有三股螺旋结构.     

载荷bFGF-PLGA微球的胶原海绵的制备及其体外缓释性能研究

在支架材料上引入具有控释行为的生长因子旨在结构与功能上模拟细胞外基质能.制备了一种载荷bFGF-PLGA微球的胶原海绵缓释体系,探讨其在体外对bFGF的释放性能.采用复乳溶剂挥发法制作微球,将微球与胶原海绵复合;通过扫描电镜观察微球和载荷微球胶原海绵的表面形态结构;利用ELISA法测试微球中药物的载药量和包封率,并对微球和载荷微球胶原海绵中bFGF的体外释放行为进行研究.结果表明:微球表面圆滑,载药量为0.059 9%±0.001 9%,包封率为79.9%±2.8%;载荷微球海绵的突释率为14.6%,低于微球本身20.0%的水平;而且载荷微球海绵的体外释放bFGF时间比微球本身更长.载荷bFGF-PLGA微球的胶原海绵缓释体系在体外能够稳定地缓释bFGF,具有较小的突释率,有望发展成为一种理想的组织工程支架材料.     

壳聚糖与胶原或海藻酸复合物海绵的制备以及人胎儿皮肤成纤维细胞在其中的生长

壳聚糖与胶原或海藻酸形成高分子离子复合物后,采用浇铸/冷冻干燥技术,制备了壳聚糖复合物海绵.表征不同组成复合物海绵的亲水性和形貌,发现加入胶原或海藻酸可增加海绵的吸水性和保水性,并有助于在海绵中形成大孔结构.海绵在pH7.4的磷酸盐缓冲液中用溶菌酶进行体外降解,复合物海绵的降解速率比单纯的壳聚糖海绵稍快.在海绵中进行人胎儿皮肤成纤维细胞的培养,发现细胞在复合物海绵中的生长增殖优于单纯的壳聚糖海绵,而且复合物海绵不会像单纯胶原海绵那样在细胞培养过程中发生降解收缩.此结果有望成为较理想的组织工程支架.     

兔皮Ⅰ型胶原的提取、改性与性能研究

采用酸溶、酶溶相结合的方法,从兔皮中提取了胶原蛋白.通过SDS-PAGE对其进行定性分析,利用FT-IR及TG/DTG表征其理化性能.结果表明,所提胶原为I型胶原,保持了完整的三股螺旋结构;热处理过程中,在100℃之前,200～450℃之间和450℃以后有3次明显失重.经戊二醛交联改性后,该胶原的含水量为(78.7±1.3)%,酶降解率从(88.65±0.11)%降为(6.03±0.38)%(p0.01).采用细胞生长抑制法测定了改性胶原对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF-WT)的细胞毒性.结果表明,改性胶原对MEF-WT细胞无明显毒性,毒性评价为0级或1级.该胶原可用于组织工程.     

基于胶原异三聚体的成骨不全症机理研究

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分,由3条链缠绕构成三螺旋.在28种天然胶原中占比最大的是Ⅰ型胶原蛋白,它是由两条a1链与一条a2链构成的异三聚体, a1或a2链中甘氨酸单点突变会导致成骨不全症.基于更接近天然胶原的异三聚体模型(abc), 3条链中分别引入Gly→Ala,构建7种突变体.差示扫描量热结果表明,单点突变体的熔融温度(T_m)值降低15℃,双点及三点突变体未形成三螺旋结构.利用梯阶模型分析分子动力学模拟轨迹,突变点附近梯阶参数值发生变化,表明三螺旋结构局部解折叠.引入弹性函数量化胶原结构变化程度,发现氢键能量与结构形变分数具有高关联性(R²=0.76),表明突变不仅破坏了氢键作用力,也导致了分子的弯曲与运动状态的变化.结合计算与实验,解析了甘氨酸突变对胶原整体结构与运动模式的影响,为进一步揭示甘氨酸突变的致病机理提供了理论基础.     

响应面法优化酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的研究

鱼鳞是鱼类加工的下脚料之一,含有丰富的蛋白质和矿质元素等营养物质,是非常好的可利用生物资源. 文中研究了碱性蛋白酶酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的优化工艺. 以ACE抑制率为指标,在酶解温度、酶解pH、加酶量、底物质量浓度等条件下先进行单因素实验,在此基础上运用响应面法优化碱性蛋白酶酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的工艺条件. 结果表明：在加酶量61%(约12 000 U/g)、pH 89、温度547 ℃的条件下酶解2 h,ACE抑制率理论值为8536%,实际酶解物的ACE抑制率为862%,相对误差为091%.     

壳聚糖与胶原或海藻酸复合物海绵的制备以及人胎儿皮肤成纤维细胞在 …

壳聚糖与胶原或海藻酸形成高分子离子复合物后，采用浇铸／冷冻干燥技术，制备了壳聚糖复合物海绵。表征不同组成复合物海绵的亲水性和形貌，发现加入胶原或海藻酸可增加海绵的吸水性和保水性，并有助于海绵中形成大孔结构。海在ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲液中用溶菌酸进行体外降解，复合物海绵的降解速率比单纯的壳聚糖海绵稍快．在海绵中进行人胎儿皮肤成纤维细胞的培养，发现细胞在复合物海绵中的生长增殖优于单纯的壳聚糖海绵，而且     

酶解法提取草鱼鱼鳞胶原蛋白的工艺研究

对酶解法提取草鱼鱼鳞胶原蛋白的工艺进行了研究,以胶原蛋白提取率作为评价指标,选择选择酶解温度、pH值、加酶量、酶解时间作为考察因素,进行了正交试验,确定最佳的提取工艺方案为A2B2C3D1,即酶解温度30℃,pH值4,加酶量2％,酶解时间1h.在该条件下草鱼鱼鳞胶原蛋白提取率为92.28％.     

鱼皮胶原蛋白的纯化及酶解性质的研究

分别对鲨鱼、鲢鱼、草鱼、罗非鱼鱼皮的胶原蛋白进行提取、纯化并进行SDS PAGE电泳分析,对它们的酶解性质进行研究.结果表明,提取的胶原蛋白有较高纯度,是典型的I型胶原蛋白.4种鱼皮胶原蛋白均能被胰蛋白酶和蛋白酶K水解,两种酶酶切位点有差异.不同鱼种鱼皮胶原蛋白的一级结构不同.本实验的酶解条件是适宜的.     

罗非鱼鳞胶原蛋白提取工艺研究

研究用胃蛋白酶从罗非鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺。根据测定水解液中羟脯氨酸(HYP)的含量计算胶原蛋白提取率,采用单因素和正交试验确定胃蛋白酶水解鱼鳞制备胶原蛋白的适宜酶解条件。结果表明,采用底物质量分数7%,胃蛋白酶酶解罗非鱼鳞制备胶原蛋白的适宜温度、pH、加酶量、时间分别为65℃、2.0、2%、2 h。在适宜工艺条件下,胶原蛋白提取率可达94.24%。     

纳米纤维素载体的超声辅助酶解法制备及表征

以微晶纤维素 (MCC)为原料， 采用超声辅助酶解法制备纳米纤维素载体（NCC），  并通过扫描电子显微镜(SEM)、 粒度分析、 Fourier变换红外(FT-IR)光谱和热重分析（TGA）NCC的形貌结构、 热稳定性和粒度大小进行表征. 结果表明： 利用MCC酶解法制备NCC的直径为10.10~18.17 nm， 长度为531.20~1 106.00 nm, 热性能更稳定.      

新型前交叉韧带支架材料的构建及其生物相容性的实验研究

探讨以聚羟基丁酸己酯/聚左旋乳酸(PHB/PLLA1∶1)胶原杂化支架作为前交叉韧带组织工程载体材料的可行性。制备"三明治"样结构PHB/PLLA共聚物并测量其孔隙率等指标。以I型胶原对制备的PHB/PLLA支架进行杂化,获得PHB/PLLA胶原杂化支架。扫描电镜观察其表面结构。将兔皮肤成纤维细胞(SF)接种于PHB/PLLA胶原杂化支架,共培养5d后,扫描电镜下观察其在材料上生长情况。PHB/PLLA支架杂化后胶原填充于纤维空隙,分布比较均匀。体外培养的皮肤成纤维细胞成功种植在支架材料上,在材料上粘附、生长良好。说明构建的支架材料具有良好的三维构型和生物相容性,有望为前交叉韧带损伤的修复提供了一种新型的支架材料。     

青少年特发性脊柱侧凸椎间盘胶原的异常代谢模式

探寻青少年特发性脊柱侧凸 (简称AIS)患者侧凸区椎间盘胶原代谢模式的异常 .实验组为顶椎为腰椎的特发性脊柱侧凸患者 2 0例 ,其中男性 4例、女性 1 6例 ,年龄 1 2～ 1 9岁 (平均 1 4 .5岁 ) .术前Cobb角 38°～ 90°,平均 60°.1 5例同年龄段先天性脊柱侧凸为对照组 .标本取自脊柱侧凸前路手术 ,取材节段为L1～L2和L2～L3 .该取材节段在实验组为侧凸顶椎区 ,而在对照组则为侧凸的下终椎区 ,胃蛋白酶 -乙酸 (0 .5mol/L)体系提取胶原组织 ,SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳法及抗原抗体Western印记法进行胶原的分类和定量测定 .在GelWork图像分析系统中进行泳道的对比定量分析 .分别计算病变组和正常组纤维环和髓核中Ⅰ型、Ⅱ型胶原含量的均值和标准差 (X±s) ,并对正常组和病变组之间差异进行显著性t检验 .结果显示AIS椎间盘纤维环和髓核含水量与对照组相比显著下降 .Ⅰ型、Ⅱ型胶原在纤维环中的含量在AIS的凹侧明显低于凸侧且有显著性差异 (P <0 .0 5) ,和对照组相比较 ,Ⅰ型、Ⅱ型胶原的含量也有显著下降 (P <0 .0 1 ) .Ⅰ型胶原在AIS椎间盘的髓核中有升高 ,而Ⅱ型胶原在髓核的凹侧凸侧没有明显的差异 ,但是和对照组相比较含量显著降低 (P <0 .0 5) .本实验所采用的胶原提取和定量分析方法具有直观性和精确性     

胶原蛋白在LB膜上的吸附行为研究

基底的性质和制备方法对吸附胶原层的超分子自组装过程有很大的影响,将一种Gemini表面活性剂C18H37(CH3)2N+-(CH2)12-N+(CH3)2C18H37·2Br-(简写为18-12-18)利用LB技术在零压下转移到云母片上制成基底,浸入到pH值为3.0的胶原溶液中37℃恒温吸附不同的时间,样品用原子力显微镜(AFM)进行表征。结果表明:在恒温过程中,LB膜上的表面活性剂分子会发生移动和翻转,胶原分子优先吸附在LB膜上形成单层网状结构,随吸附时间的延长,胶原分子也会在云母上发生吸附,最后两者会交织成无序的胶原纤维。     

星点设计-效应面法优化鹿角多肽酶解工艺

采用星点设计-效应面法优化鹿角多肽酶解工艺。煎煮法提取鹿角胶后经胃蛋白酶水解得到鹿角多肽，采用单因素法初步考察底物浓度、酶用量、温度、pH、酶解时间等因素对多肽峰面积及含量的影响；再以底物浓度、酶用量、温度为自变量，双缩脲法测得多肽含量及HPLC法测得峰面积总和为因变量进行星点设计试验，确定最佳酶解工艺，并进行验证。结果表明，星点设计 效应面法得到的最佳酶解条件为酶用量1.8%、底物浓度0.08 mg/mL、温度40 ℃。该方法简便、可行、稳定，预测性良好。