鲍的遗传育种研究进展

鲍是我国重要的海水经济养殖贝类,年产值位列福建省水产养殖种类之首,其遗传改良研究对于我国鲍养殖产业的可持续发展起到重要的支撑作用.本文综述了本课题组过去20余年在鲍的种质资源保存和遗传评估、抗逆性状的精准测评、选择与杂交育种、分子标记的开发与应用、重要经济性状的遗传解析等方面的研究进展,介绍了杂色鲍"东优1号"、西盘鲍...     

不同地理种群杂色鲍的同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳技术，对采白海南三亚、香港和福建平潭3个野生杂色鲍种群，以及1个种源来自台湾的九孔鲍养殖群体共4个群体的6种同工酶系统进行分析，共检测到10个基因位点，其中2个为多态位点(多态位点比例为20％)，每个位点平均等位基因数为1．2；4个群体都不同程度地表现出纯合子过剩、杂合子不足，遗传变异量偏低．群体间遗传相似系数与遗传距离以及UPGMA聚类分析的结果表明：4个群体之间的遗传差异不大，遗传距离均小于0．01．属于种群差异水平．九孔鲍和杂色鲍的遗传差异达不到亚种水平．     

杂色鲍血清凝集素的初步研究

研究结果表明,杂色鲍血清中自然存在凝集素,该凝集素能够识别和凝集多种不同的细菌和人及动物的红细胞,其中对人体O型和B型血细胞的凝集效价显著高于A型和AB型血细胞(P<0.05);Ca2+能促进其凝集活性,而Mg2+则抑制其凝集活性;凝集作用不同程度地受反应介质的pH、离子强度及反应时间等因素的影响;该凝集素不被透析,在95℃、pH2.0～10.0时仍保持凝集活性,抗RNase、DNase、SDS和乙醚,对蛋白酶K、糖氧化剂NaIO4敏感;凝集素活性能被D-树胶醛糖、L-鼠李糖特异性抑制,D-果糖、D-木糖对其也有显著的抑制作用.     

杂色鲍×盘鲍杂交及亲本自繁群体的AFLP分析

应用AFLP技术研究了杂色鲍(SS)、盘鲍(JJ)及其正反交群体(SJ和JS)的遗传关系,并比较了各群体内的遗传多样性.3对选择性引物共扩增出344个位点.双亲自繁群体SS和JJ 的AFLP图谱差异很大,平均遗传距离达1.425.因此,AFLP图谱可以用于两物种及其杂交种的种质鉴别.正反交群体SJ与JS的AFLP图谱很接近于母本自繁群体,平均遗传距离分别为0.111(SJ与SS之间)和0.134(JS与JJ之间),而与父本自繁群体则有较大区别,平均遗传距离分别达1.408(SJ与JJ之间)和1.394(JS与SS之间).将4个群体分为SS/SJ和JS/JJ两组,进行三水平的AMOVA分析,结果显示:84.74%遗传变异来源于母本不同的两组之间(SS/SJ组和JS/JJ组之间),12.66%变异存在于群体内个体之间,正反交群体与母本之间的变异仅有2.60%.另一方面,正反交F_1群体的多态性位点比例、Nei′s 遗传多样度、香农多样性指数均低于母本自繁群体.综合群体内多样性和群体间遗传关系分析结果,杂色鲍与盘鲍正反交F_1的遗传物质组成有别于同时含有双亲基因组的实质性杂交,而与母本有着高度的遗传同质性,且遗传多样性水平略低于母本自繁群体.     

杂色鲍日本群体与台湾群体杂交的初步研究

采用杂色鲍日本群体(RB)和台湾群体(TW)进行群体间杂交及群体内自繁,得到RB♀×TW♂、TW♀×RB♂、TW♀×TW♂和RB♀×RB♂4个组合的F1代.对这些交配组合的卵径、受精率、胚胎发育速度、幼体附着率、幼体变态率、幼体存活率以及稚贝早期生长进行了比较.结果表明,杂交组与自繁组在卵径、受精率以及胚胎发育速度方面并无显著的差别,但杂交组在幼体附着率、幼体变态率、幼体存活率以及稚贝早期生长方面,与自繁组相比表现出不同程度的杂种优势.TW♀×RB♂组8 d的存活率杂种优势达到40.6%,RB♀×TW♂组25 d壳长的杂种优势达到48.6%.实验初步显示,不同地理群体间的杂交将可能是养殖杂色鲍遗传改良的有效途径.     

杂色鲍肌动蛋白启动子的克隆与序列分析

杂色鲍(H.diversicolor diuersicolor)是我国华南地区重要的海水养殖对象,作为利用转基因技术改良杂色鲍品质研究工作的首要部分,作者利用PCR和染色体步移(Genome Walking)方法克隆了杂色鲍肌动蛋白基因编码区部分序列和启动子序列(GenBank登陆号:EU622901).所分离的肌动蛋白基因DNA序列片段全长为1 990 bp,与GenBank中彩虹鲍(Haliotis iris)肌动蛋白A1基因序列和肌动蛋白A1a基因序列有非常高的相似性(99%和96%).在基因编码区中间发现了一个内含子区,在编码区之前发现一个类启动子区,经过Promoter Prediction在线软件分析,发现了该启动子序列和转录起始位点,同时也发现了该启动子特有的启动元件两个标准的CAAT BOX和一个TATA BOX.这些实验结果表明所克隆的杂色鲍肌动蛋白和启动子序列符合实验的目的.并且这一实验的成功也为下一步利用所分离的启动子做杂色鲍转基因工作打下基础.     

杂色鲍肠道益生菌的分离和鉴定

从杂色鲍(Haliotis diversicolor)肠道内,共分离出84株细菌,经16S rRNA基因序列比对,共产生了35种类型(OTU),分属于17个属,利用纸片扩散法进行了细菌消化酶活性及抑菌活性检测.有75株菌在不同程度上表现出淀粉酶活性、蛋白酶活性、脂肪酶活性、琼胶酶活性、纤维素酶活性或褐藻酸钠酶活性;有24株菌不同程度地抑制2～8株致病菌的生长.结合实验结果,对9株潜在益生菌进行溶血实验检测及动物安全性实验.其中AP12和AP34不产生溶血素,并且在菌株浓度108 CFU/g时对鲍无明显的毒害作用,表明此2株细菌可以作为潜在的益生菌应用于杂色鲍的养殖.AP34具有5种消化酶活性,与fu同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)16S rRNA基因序列同源性最高,为99.87％;AP12对8株致病菌均表现出较强的抑菌活性,该菌16S rRNA基因序列与济州岛褐色杆菌(Phaeobacterdaeponensis)相似性最高,为98.63％.     

杂色鲍♀×盘鲍♂合杂交受精的细胞学研究

应用组织学方法。研究了杂色鲍♀×盘鲍♂舍种间杂交受精过程的核相变化。结果表明杂色鲍♀×盘鲍♂种间杂交受精主要表现出两性融合的特点．盘鲍精子进入杂色鲍卵子。9min后中心粒发育为星光；精子头部逐渐膨大、液化形成雄性原核，39min后与雌性原核会合，而后融合．约3．2％的受精卵中观察到1个受精卵中同时存在3个即将融合的原核，这可能是多精入卵或卵子染色体组自发加倍的结果．42min后开始第1次有丝分裂。此时在极个别发育卵中发现固缩的染色质小体、微核、或分离不同步的染色体．     

不同饵料对杂色鲍幼鲍生长及存活的影响

选用南方鲍养殖业中常用的4种大型海藻细基江蓠、菊花江蓠、龙须菜和海带,研究在单一饵料、混合饵料、轮流饵料3种不同的投喂方式下共12个饵料处理组对杂色鲍(Haliotis diversicolor)幼鲍生长、存活的影响.实验进行40 d,结果表明:1)不同饵料处理组幼鲍均保持较高的存活率,其中细基江蓠组的存活率最低;2)不同饵料处理组的生长存在显著性差异(p0.05).在单一饵料组中,海带组的特定生长率显著高于其他3种单一饵料组(p0.05).在混合饵料组和轮流饵料组中,细基江蓠和菊花江蓠饵料组合的特定生长率明显低于其他的饵料组合(p0.05).而相同的饵料组合在混合、轮流两种投喂方式下特定生长率无明显差异(p0.05).另外常用的表征生长速度的指标如壳长日增长、日增重、壳长增长率、增重率均具有相似的趋势;3)海带组的日摄食率和体质量壳长比显著大于细基江蓠组(p0.05),各饵料处理组的食物转化率无显著差异(p0.05).实验结果表明:采用混合饵料和轮流饵料与单一饵料的投喂方式相比,可明显提高鲍的生长速度.     

九孢鲍暴发性流行病的病原及病理

1999年2－5月,山东县养殖九孔鲍暴发了大规模流行病,不少养殖场全场覆没,病鲍表现为分泌粘液增多、肝脏红肿、中部僵硬和反应迟钝,应用磷钨酸负染、超薄切片的电镜和现场检测等方法,对病鲍的病原及肝肠组织的病理情况进行观测,结果表明引发这次养殖暴发严重病害的主要病原是致病力很强的病毒和弧菌,电观察到病毒发生在细胞质中的一种称为“封入体”的泡状结构,证实了病原的入侵造成九孢鲍肝及肠等组织、细胞产生病变,描述了细胞和病毒混合感染导致九孔鲍细胞的病理变化。     

九孔鲍二倍体与三倍体核型的研究

九孔鲍二倍体细胞染色体数及核型为：2n=32，18m 6sm 8t，NF=56，第1、2、3、4、6、7、9、10、11对为中部着丝粒染色体(m)，第5、8、12对为亚中着丝粒染色体(sm)，第13、14、15、16对为端着丝粒染色体(t)，三倍体细胞染色体数及核型为：3n=48，30m 6sm 12t，NF=84，第1、2、3、4、5、7、8、9、10、12组为中部着丝粒染色体(m)，第6、11为亚中部着丝粒染色体(sm)，第13、14、15、16组为端着丝粒染色体(t)。     

九孔鲍血细胞的研究

采用May Grunwald-Giemsa染色法研究九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexa)血细胞的显微结构,根据细胞大小和核质比将九孔鲍血细胞分为3类:大细胞、中等细胞和小细胞.血细胞密度为(8.32±4.76)×106/mL,大细胞、中等细胞和小细胞分别占血细胞总数的3.6%、91.7%和4.7%.透射电镜下血细胞可分为两类:颗粒细胞对应于光镜下的大细胞和中等细胞;无颗粒细胞对应于光镜下的小细胞.用细胞化学的方法证明九孔鲍血细胞中含有多糖、酸性磷酸酶、非特异性酯酶和过氧化物酶,它们的阳性率分别为57.3%、95.2%、86.3%、6.7%;但是根据血细胞的这几种成分不能区分血细胞的类型.     

金属离子对鲍鱼碱性磷酸酶活力的影响

碱性磷酸酶(ALP,EC3.1.3.1)是一种金属酶,其结构的维持和酶活性的表现均需金属离子.本文研究了几种金属离子分别对鲍鱼ALP活力的影响.结果表明,Li ,Na 和K 等正一价碱金属离子对酶活力没有任何效应;碱土金属离子Mg2 ,Ca2 和Ba2 对酶有激活作用,其激活程度依次为:Mg2 >Ca2 >Ba2 ,而且Mg2 在5.0mmol/L时可以使酶活力提高267%;在过渡金属离子中,Zn2 ,Mn2 ,Co2 和Cu2 对酶的效应不同,Zn2 、Cu2 为抑制作用,而Co2 、Mn2 表现为激活作用;重金属离子Hg2 、Pb2 、Ag 和Cd2 对酶有抑制作用,其中Hg2 的抑制效应最强,1.0mmol/LHg2 可使酶活力抑制94%.研究Mn2 和Cu2 的抑制类型表明,Mn2 为混合型激活作用,而Cu2 对酶的抑制类型为非竞争性抑制作用,其抑制常数(KI)为0.316mmol/L.     

鲍鱼碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究

以杂色鲍(Haliotis diversicolor)内脏为原料,经Tris HCl缓冲液(pH 7.5,含0.1mol/L NaCl)抽提,正丁醇处理,硫酸铵分级沉淀分离,DE 32离子交换、Sephadex G 150分子筛、DE 32纯化,得到电泳单一纯的碱性磷酸酶制剂,比活力为1 226 U/mg.酶学性质和动力学性质研究表明:该酶催化对硝基苯磷酸水解反应的最适 pH值为 10.08,最适温度为48℃.米氏常数Km 值为0.80 mmol/L,Vm 值为20.1 mmol/L·min-1(pH 10.0,37℃).酶的热稳定性研究表明:该酶在pH 7~11区间和在温度低于55℃下稳定.金属离子对酶活力的影响结果表明:Li+、Na+和K+对酶活力没有影响,Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+和Co2+对酶有不同程度的激活作用,而Cu2+、Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ag+、Bi2+和Pb2+等对酶起抑制作用.     

鲍鱼多糖Hal-B的组成研究

从鲍鱼中分离一种硫酸酯多糖Hal-B，甲醇解反应后，经三甲硅醚衍生化，GC／MS检测，结果表明该我糖主要是由半乳糖、葡萄糖和少量木糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸组成。     

乙醇对鲍鱼碱性磷酸酶活力与构象的影响

以乙醇为效应物研究对鲍鱼碱性磷酸酶(ALP)活力影响的结果表明．酶的剩余活力随着乙醇浓度增大而迅速下降，乙醇浓度40％可使酶活力完全丧失．说明乙醇对鲍鱼ALP有明显的失活作用，JG50为13％．含较低浓度乙醇(30％)的失活过程是可逆的反应．测定乙醇对酶的失活作用机理．结果表明乙醇对鲍鱼ALP的失活作用是非竞争性机制，说明底物存在不影响乙醇对酶的失活作用．应用荧光光谱、紫外吸收光谱研究鲍鱼ALP经乙醇微扰后的分子构象变化，发现乙醇对酶分子构象有显的影响，酶的内源荧光强度随乙醇浓度增大而增强．荧光发射峰逐渐发生红移．紫外吸收光谱在276nm吸收峰随乙醇浓度增大而增强．这些结果表明．酶蛋白分子中的生色基团残基的微环境发生变化．     

九孔鲍摄食海带的能量收支研究

在室内水族箱投喂新鲜海带养殖九孔鲍(Haliotis diversicolor aquatiliis)．实验结果表明，个体耗氧率在夜晚高，白天低，最高是在17：30～2l：30．摄食能(C)中，只有少部分(2.60％)的能量用于软体部和壳的生长，而很大一部分能量(52．86％)是在代谢能(R)中，排泄能(U)、排粪能(F)、粘液(M)和壳能(Pah)分别占摄食能的9．69％、12．33％、6．61％和0.26％，鲍能量收支方程为：100％(C)=12．33％(F) 5286(R)％ 9．69％(U) 6．61％(M) 2.33％(Pg) 0．26％(Pah) 15．90％。