X连锁凋亡抑制蛋白对肺癌细胞生长和细胞周期的影响

为了研究靶向X连锁凋亡抑制蛋白的发夹状RNA对肺癌细胞中抗肿瘤作用,构建XIAP基因的shRNA表达载体,并设计阴性对照(psiRNA-Con)质粒,分别转染A549细胞;实时定量PCR和免疫印记法分别检测XIAP的mR-NA和蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐试验(MTT)检测A549细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期分布。实验结果表明:转染psiRNA-XIAP组细胞XIAP mRNA和蛋白水平均低于正常对照组,生长慢于正常组(t=16.82和t=12.13,均P<0.01),G2/M期细胞所占比例增高(t=3.78,P<0.05),并出现亚G1峰。而阴性对照质粒psiRNA-Con未能下调XIAP的表达水平,对A549细胞增殖和细胞周期亦无明显影响。结论:针对XIAP的RNA干扰质粒特异性地抑制了其RNA和蛋白水平,使肺癌细胞A549生长减慢,诱导凋亡,并使其发生G2/M期阻滞,有望发展为新的抗肿瘤药物。     

长链非编码RNA HAGLROS对非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨长链非编码RNA HAGLROS(lncRNA HAGLROS)对非小细胞肺癌A549细胞系迁移和侵袭能力的影响.方法采用siRNA(小RNA干扰技术)对细胞进行转染;同时采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)检测相关目的基因的表达水平;应用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力;应用Transwell实验检测细胞的侵袭能力.结果 qPCR结果显示:对A459细胞进行转染后,siRNA-lncRNA HAGLROS-homo-435敲减效率最高,差异具有统计学意义(P0.05);划痕实验和Transwell实验结果表明:实验组与对照组比较,细胞迁移能力、细胞侵袭能力均下降,差异具有统计学意义(P0.05).结论 lncRNA HAGLROS在肺癌细胞系A549中作为促癌基因发挥作用,可为肺癌的诊断及治疗提供临床参考.     

补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞药物泵P-gp及LRP蛋白表达的影响

目的:用补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,观测药物泵P-gp及LRP的表达,并同小干扰RNA片段(siRNA)靶向切除P-gp、LRP基因后对这两种蛋白表达的影响相比较.方法:补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,设计并合成针对P-gp、LRP基因对应序列的siRNA,采用转染试剂对细胞进行转染.两种蛋白实验分组均为:空白对照组、含药血清处理组及siRNA处理组.采用RT-PCR检测P-gp及LRP mRNA,免疫细胞化学法检测蛋白表达及定位,WB检测蛋白表达.结果:补中益气汤含药血清可以降低两种药物泵的表达,效果同siRNA类似,具有统计学差异(P0.05).结论:补中益气汤含药血清能降低A549/DDP细胞上P-gp和LRP的表达.     

扁塑藤素对非小细胞肺癌增殖及线粒体膜电位的调节作用

目的 分析扁塑藤素对体内外非小细胞肺癌增殖及线粒体膜电位的调节作用,初步探讨扁塑藤素的抑瘤增殖效果及可能机制.方法 将适量的扁塑藤素提取物分别作用于非小细胞肺癌细胞系(A549及H226)及动物模型(BALB/c裸鼠),应用MTT方法测定其细胞存活率,应用细胞集落实验检测其长期毒性作用.制备A549非小细胞肺癌裸鼠模型,测定PTM对移植瘤体积及湿重的生长抑制.应用流式细胞术测定PTM共培养后细胞线粒体膜电位.结果 与空白对照组比较,A549和H226两组细胞随PTM剂量的增加及共培养时间的延长细胞的平均存活率显著降低.与对照组(PTM:0μmol/L)比较,0.1μmol/L组A549及H226的细胞集落形成均受到抑制,并且0.2μmol/L组的细胞集落形成抑制更为明显.PTM腹腔内注射治疗第7天,PTM 2 mg/kg治疗组的移植瘤(A549)体积抑制作用优于PTM 1 mg/kg治疗组(P<0.05).湿重对比分析结果显示:PTM 2mg/kg治疗组移植瘤湿重低于空白组及PTM 1 mg/kg治疗组(P<0.05).流式细胞术测定结果显示:PTM(8μmol/L)对各组细胞(A549和H226)作用时间持续3 h即可导致细胞线粒体膜电位下降,持续6 h时线粒体膜电位下降更为明显,提示PTM作用时长与细胞(A549和H226)线粒体膜电位呈负性相关.结论 PTM对体内外非小细胞肺癌(A549和H226)的细胞抑制作用存在剂量和时间依赖性,并初步证明PTM具有诱导细胞线粒体去极化的作用.     

“聊红椿”提取物对非小细胞肺癌的抑制作用

目的探讨"聊红椿"提取物对非小细胞肺癌的抑制效果,研究其作用机制。方法通过有机溶剂萃取法,提取"聊红椿"中有效成分;将其作用于人肺癌细胞系A549,MTT法检测A549细胞增殖情况;流式细胞仪考察A549细胞凋亡情况;进一步通过荧光定量PCR和Western blot考察细胞凋亡因子Caspase-3,Bax,Bcl-2,cleaved PARP的mRNA和蛋白水平表达情况;构建肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型,将低、中、高剂量"聊红椿"提取物分别腹腔注射干预治疗,作用一定时间后,测量小鼠肿瘤生长情况。结果 HPLC分析发现,与正常臭椿相比,"聊红椿"提取物中有高含量有效成分臭椿酮;MTT实验结果发现,"聊红椿"提取物能够明显抑制A549细胞增殖;流式细胞仪检测结果发现,"聊红椿"提取物能够诱导A549细胞发生凋亡;荧光定量PCR和Western blot实验结果发现,"聊红椿"提取物能够使得细胞凋亡因子Caspase-3,Bax和cleaved PARP含量显著下降,抗凋亡因子Bcl-2含量显著增加;"聊红椿"提取物作用于肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型后,肿瘤质量和直径明显下降,且与处理浓度呈反比。结论"聊红椿"提取物能够通过影响相关细胞凋亡因子的表达,显著抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

真核延伸因子-1A2基因在宫颈癌侵袭和迁移中的作用研究

目的探讨真核延伸因子-1A2(eEF1A2)基因对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法设计eEF1A2基因的siRNA干扰片段分别转染宫颈癌SiHa细胞、HeLa细胞和C33A细胞,实验组包括:转染Si-eEF1A2-1和SieEF1A2-2的细胞组,未转染的细胞和非干扰转染细胞(NC组)为对照组。采用Western blot方法检测eEF1A2和E-cadherin在宫颈癌细胞中蛋白质表达水平,通过划痕实验和基质胶包被transwell实验分析细胞迁移能力,通过CCK-8实验和平板克隆实验检测细胞增殖。结果宫颈癌细胞中,siRNA干扰的细胞与对照组相比eEF1A2蛋白质表达水平降低,E-cadherin蛋白质表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);划痕实验si-eEF1A2转染的细胞与对照组相比较,愈合间隙宽,差异有统计学意义(P0.05); Transwell迁移实验,RNA干扰的细胞与对照组相比,穿过小室基底膜的细胞明显少于对照组,差异有统计学意义(P0.05); si-eEF1A2干扰的细胞CCK8增殖实验、细胞克隆形成实验中可以抑制宫颈癌细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05)。结论降低宫颈癌SiHa、HeLa和C33A细胞eEF1A2基因表达水平,可以抑制癌细胞的侵袭和迁移。     

低表达长非编码RNA MALAT1对人宫颈癌HeLa细胞体外生长和迁移的影响

设计3个针对MALAT1不同靶序列的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 筛选出有效的siRNA序列, 设计并构建短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰质粒, 转染到HeLa细胞中, 构建低表达MALAT1的稳定细胞株.通过细胞的生长曲线和细胞划痕实验验证降低MALAT1对HeLa细胞增殖和迁移的影响.结果显示MALAT1表达水平在HeLa细胞中得到有效地降低, 低表达MALAT1的HeLa细胞生长速度和迁移速度减小.表明MALAT1在HeLa细胞中具有调控细胞增殖和迁移的能力     

IL-24联合大蒜素体外抗肺癌细胞生长的实验研究

目的探讨抑癌基因IL-24联合大蒜素对肺癌A549细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法提取前期构建的p DC316-h IL-24-EGFP质粒,转染肺癌A549细胞,分为A组(空白对照组)、B组(单独大蒜素组(40μL/m L))、C组(脂质体+IL-24组)、D组(大蒜素(40μL/m L)+脂质体+IL-24).荧光显微镜下观察质粒的转染情况;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot法检测p DC316-h IL-24-EGFP、大蒜素和联合用药作用A5 4 9细胞4 8 h后IL-24,Bax,Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平.结果大蒜素(40μL/m L)和p DC316-h IL-24-EGFP单用48 h对A549细胞均有明显抑制作用;大蒜素(40μL/m L)联合p DC3 1 6-h IL-24-EGFP比单用p DC3 1 6-h IL-24-EGFP作用更强(P0.05);大蒜素(40μL/m L)、p DC316-h IL-24-EGFP和两药联用48 h后,A549细胞凋亡率分别为32.7%,39.4%和68.8%;大蒜素(40μL/m L)和/或IL-24作用于A549细胞48 h后,Bax/Bcl-2的比值及Caspase-3表达均上调,联合用药组效果尤其明显.结论p DC316-h IL-24-EGFP联合大蒜素可协同抑制人肺癌A549细胞生长,机制可能是通过调节基因Bax/Bcl-2的表达比率,并上调Caspase-3的表达,进而诱导A549细胞的凋亡.     

肺癌A549细胞COX-2与MMP-2表达的关系

目的:探讨肺癌A549细胞环氧化酶-2(COX-2)表达和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达之间可能潜在的关系.方法:①用Western blot法检测对照组和干预组(5、10、15μg/mL脂多糖(LPS)干预12 h,10 μg/mL的LPS干预6、12、24 h)A549细胞MMP-2蛋白质表达;②用ELISA法检测对照组和干预组A549细胞培养上清液COX-2活性产物前列腺素E2(PGE2)及MMP-2的变化.结果:①在5、10、15μg/mL的LPS 12 h诱导下,肺癌A549细胞MMP-2蛋白表达及MMP-2和PGE2的分泌增加;②10 μg/mL的LPS干预肺癌A549细胞6、12、24 h后MMP-2蛋白表达及MMP-2和PGE2的分泌增加;③肺癌A549细胞PGE2与MMP-2正相关(r1=0.980,r2=0.975).结论:①肺癌A549细胞PGE2与MMP-2密切相关;②肺癌A549细胞可能通过激活肺癌A549细胞MMP-2,参与肺癌的侵袭与转移.     

Survivin-siRNA真核重组质粒的构建及对前列腺癌DU145细胞增殖抑制作用

目的应用RNA干扰技术(RNAi),构建针对凋亡抑制因子survivin的siRNA,并检测其对DU145细胞增殖抑制的影响.方法构建重组质粒shRNA-sur1和shRNA-sur2并分别转染DU145细胞株,通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞的增殖抑制作用及凋亡的影响.结果成功构建针对survivin干扰的两种真核表达质粒,转染72 h后,两个实验组细胞的生长速度分别是脂质体组的(37.2%±5.8%)(n=3)和(43.5%±7.2%)(n=3).流式细胞术发现:实验组细胞的G1期细胞比例明显高于对照组,而G2期和S期细胞比例减少,细胞出现凋亡,与脂质体组比较,两实验组细胞的凋亡率分别为(21.70%±6.45%),(14.835±5.65%).结论成功构建针对survivin siRNA的真核重组质粒,两种质粒体外均可抑制DU145增殖并诱导其凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉默提供良好的基础.