用微量单管RT-PCR快速检测及定型脊髓灰质炎病毒

介绍一种逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的简单快速检测和定型脊髓灰质病毒（ＰＶ）的方法，无需提取ＰＶＲＮＡ共用一种缓冲系统，将ＲＴ和ＰＣＲ试剂混合在２０μＬ反应体系中，整个操作可置于一不间断温度循环程度程序中完成，一步法ＲＴ－ＰＣＲ与常ＲＴ－ＰＣＲ及中和抗体试验对ＰＶ的检测结果完全一致，它的检测敏感度可达５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ，该法需要时间，费用和污染的都大大减少，而且特别适于临床常规诊断和鉴别     

荧光定量RT-PCR检测脑心肌炎病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank中公布的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus EMCV) 3D基因保守区段设计并合成1对引物, 以提取的EMCV核酸为模板, 分别进行荧光定量RT PCR扩增, 优化反应体系及条件, 建立脑心肌炎病毒荧光定量RT PCR检测方法, 并初步运用于静注人免疫球蛋白(IVIG)纳米膜过滤工艺去除EMCV效果的验证. 结果显示该方法实验内和实验间的精密度均小于5%, 最低检测限为102 copies/ μL; 纳米膜过滤工艺可使样品中的EMCV滴度下降4Logs.     

亚洲一型口蹄疫病毒YNAs1.1株结构蛋白VP1基因的核苷酸序列分析

提取BHK21细胞增殖的亚洲一型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus Serotype Asial)强毒株YNAs1.1的RNA,用一对引物P7,P13经反转录（RT）－PCR法扩增了约674bp的DNA片段。克隆目的基因后,采用双脱氧DNA链末端终止法测得了YNAs1.1的VP1基因36－633核苷酸序列。分析表明,病毒VP1基因的核苷酸序列与以色列以及印度已报道的Asia1型FMDV的同源性分别为82.11%与88.07%,对应的氨基酸序列同源性为87.94％与93.47％。该序列在GeneBank登陆号为AF241566。     

鸡传染性法氏囊病的RT—PCR诊断方法的研究

在研究鸡法氏囊病毒（HBDV）的A片断cDNA结构的基础上，建立了RT－PCR早期诊断技术，结果表明，使用PrimerDesign引物设计软件，在VP5和VP2的重叠基因区设计的一对引物具有非常高的同源性和保守性，采用的四种IBDV的标准毒株，一种野毒株和一例病鸡标本通过此引物进行RT－PCR检测均得到了明显的阳性扩增结果，而两种其他鸡病病毒和一例健康鸡的法氏囊组织扩增均为阴性结果。     

葡萄卷叶病病毒双链RNA(dsRNA)提纯分析研究*

以传统的检测方法为对照经过一系列的筛选后,在国内首次将病毒的ｄｓＲＮＡ检测分析引入果树无病毒苗的检测方法之中,确立了葡萄病ｄｓＲＮＡ的提取步骤,包括试剂选择、浓度的设定、操作方法的确立,与国外文献相比有多方面的改进,使其更加简单、实用,并在实际的应用当中取得成功。在确立方法的基础上对生产中广泛发生的葡萄卷叶病病毒（ＧＬＲｖ）进行检测并确立检测标准,为今后葡萄病毒病的诊断检测奠定了良好的基础。     

丙型肝炎病毒核酸疫苗的研究

从丙型肝炎病人的阳性血清中提取出丙型肝炎病毒ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得丙型肝炎病毒Ｃ区基因片段。并将此片段克隆到真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋），得到重组质粒ｐｃＤＮＡ－ＨＣＶ／Ｃ，再将其通过肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／小鼠后，小鼠产生了抗ＨＣＶ／Ｃ区抗体。     

RT—PCR技术对BTV群,型特异性鉴定的研究

根据蓝舌病毒（ＢＴＶ）Ｌ２,Ｌ３核苷酸序列,设计,合成引物,建立ＢＴＶ群,型特异性ＲＴ－ＰＣＲ鉴定方法,对我国地方毒株进行群,型鉴定,结果表明;群特异ＲＴ－ＰＣＲ方法能覆盖目前我国已知或可能存在的ＢＴＶ血清型,与相关病毒无交叉反应,ＢＴＶ－１、ＢＴＶ－１６型型特异ＲＴ－ＰＣＲ方法对本型有专一性,用于检测临诊血样和组织样中ＢＴＶ的感染,结果证实该方法快速,敏感,特异。可作为临诊和进出口动物检疫中蓝舌     

对虾桃拉病毒(TSV)RT-PCR快速诊断技术的研究

对虾桃拉病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)最早于1992年在凡纳对虾(Penaeus vannamei)体内发现，此病毒是对虾养殖业危害较严重的病毒之一．将该病毒基因组的一段序列克隆至转录载体pSP64(PolyA)上。经体外转录、磁珠法分离、纯化获得了人工的TSV-RNA模板；用定量的TSV-RNA阳性对照模板进行RT-PCR条件优化。灵敏度检测以及样品制备方法等试验，结果表明：RT-PCR检测的灵敏度可达到0．1fg，相当于100个病毒粒子；所制备的样品对病毒RNA的逆转录及扩增无抑制，适合于对虾桃拉病毒快速检测．     

猪瘟病毒RT—PCR产物的T载体克隆,测序及同源比较

利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶的无模板延伸活性制备了可直接克隆ＰＣＲ产物Ｔ载体，苗对猪瘟病毒ＨＣＬＶ株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行了克隆。     

利用原位RT-PCR技术检测库尔勒香梨中苹果茎沟病毒

以已知带有苹果茎沟病毒的香梨的叶片为材料,研究了香梨病毒叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术.应用了直接原位RT-PCR反应,简化了试验步骤,缩短了试验周期,确定了苹果茎沟病毒在叶片中的分布位置.试验中设置了多种阴性对照,结果表现为:阴性对照组织中均未显现蓝紫色,而阳性材料组织的一些细胞表现出明显的蓝紫色,说明苹果茎沟病毒在叶片中主要分布于细胞中的栅栏组织.     

一步法RT—PCR检测石蜡包埋滑膜肉瘤中SYT—SSX融合基因的表达

运用一步法RT－PCR技术检测14例石蜡包埋滑膜肉瘤组织中t(x;18）(p11.2;q11.2）染色体易位所致的融合基因SYT－SSXmRNA的表达,尤文氏肉瘤和恶性黑色素瘤各一例做对照。结果表明,14例滑膜肉瘤中12例有SYT－SSX融合基因的表达（85．7％）,尤文氏肉瘤和恶性黑色素瘤均有阴性。     

逆转录聚合酶链式反应快速检测水稻条叶枯病毒

逆转录聚合酶链式反应（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＲＴ－ＰＣＲ）具有灵敏度高,准确性好的特点,因而被广泛应用于植物病毒检测。在ＲＴ反应中,ＲＮＡ样品的快速制备尤为重要用异丙醇二步沉淀法获得ＲＮＡ,快速检测水地片中ＲＳｔＶ伯ＲＴ－ＰＣＲ方法,可使测定时间缩短至６ｈ,并可从０．０７８ｍｇ感病叶片中检测出ＲＳｔＶ。     

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的 建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法 根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果 本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论 本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.     

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型症状的病犬肠溶物经ＳＤＳ－酚裂解法提取总ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,通过人工合成的两条２０ｍｅｒ引物进行ＰＣＲ扩增,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白ＶＰ２基因中间１／３区段,ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳,试验结果表明：用ＰＣＲ扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性,应用该方法检测的２７份病犬肠溶物样品块获得了预计长度的ＤＮＡ片段（５３１ｂｐ）,而健康犬的肠溶物样品ＰＣＲ结果为     

葡萄病毒B优化检测体系的建立

为了解决种苗检疫、抗病性早期鉴定等基本问题,为葡萄无毒化栽培的提供基本保障。本实验从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板进行一步RT-PCR扩增,并利用此扩增产物为模板进行二次扩增,二者均能获得与预期片段大小一致长约460bp和243bp的扩增产物,在此基础上,建立了萄病毒B的一步RT-PCR、巢式PCR以及斑点杂交优化检测体系。利用本实验所建立的优化检测体系对葡萄样本进行检测,表现出了良好的特异性与稳定性。     

猴空泡病毒(SV40)PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测实验猴及生物制品中猴空泡病毒(SV40)的PCR方法。方法根据SV40-776株设计合成三对引物对现有毒株进行PCR扩增并克隆测序。用这三对引物对56份猴肾、肺、脾及10批脊髓灰质炎疫苗进行检测。结果三对引物均扩增出目的片段;56份猴脏器和10批疫苗SV40检测均为阴性。结论56只恒河猴和10批疫苗中未检测到SV40,所设计的三对引物检测结果准确,均可用于检测。     

应用PCR技术检测单纯疱疹病毒

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，检测２０５例样本，其中单纯疱疹病毒阳性６５例，阳性率３１．７％．ＰＣＲ技术具有高度的敏感性和特异性，为疱疹病毒感染的临床早期准确诊断、判定药物疗效和流行病学研究等提供了有效的手段     

应用聚合酶链反应检测环境污水脊髓灰质炎病毒的研究

用聚合酶链反应技术检测５个市县１５份环境污水中肠道病毒，其中１１份阳性，与细胞中和试验鉴定阳笥结果符合率９０．９０％－１００％，该法不仅简单，敏感，特异分型，而且可作型内鉴别，使细胞中和试验分型和Ｔ特征型内鉴别所需１４ｄ缩短到２ｄ。为环境样品中脊髓灰质炎病毒污染提供了检测手段。     

中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据小ＲＮＡ 病毒科（ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ） 中病毒ＲＮＡ 所具有的结构特征, 采用ｍＲＮＡｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ 提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒（Ｃｈｉｎｅｓｅｓｃａｂｒｏｏｄ ｖｉｒｕｓ ＣＳＢＶ） 的ＲＮＡ, 并以之为ｃＤＮＡ合成的模板． 依据小ＲＮＡ病毒科中的脊髓灰质炎病毒结构蛋白基因序列设计了一对引物ＶＰ５和ＶＰ３ , 通过ＰＣＲ 扩增获得预期大小约为１ １００ ｂｐ的ＤＮＡ 片段, 将此片段克隆到ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体上并直接测序． 序列分析表明, 该片段为中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因, 与意蜂幼虫囊状病病毒结构蛋白基因序列的同源性为８６－８ ％ , 与之对应氨基酸序列的同源性高达９３－４ ％ ． 该病毒株为一种新型的蜜蜂囊状幼虫病病毒株     

PCR用于孕牛外周血中胎儿SRY序列检测和奶牛早期胚胎性别鉴定

根据文献报道的人，鼠，兔ＳＲＹ同源序列设计引物，从牛基因组中扩增出一段牛特异的ＳＲＹ序列，对该序列进行克隆测序后设计出一对雄牛特异的ＰＣＲ引物，利用此引物对奶牛早期胚胎细胞和妊娠晚期母牛外周血ＤＮＡ样品进行ＰＣＲ扩增，经分娩牛犊性别验证，本引物能够准确鉴别孕牛外周血中雄性胎儿的ＳＲＹ序列，并且对早期胚胎性别签定的准确率为８０％．