人和鼠脑cDNA文库的建立以及全长cDNA的批量分离

应用λZAP Express cDNA文库构建试剂盒构建了人3个月和8个月胎儿脑及大小鼠脑cD-NA文库.第2链cDNA经Sepharose CL-4B凝胶过滤层析后去除了较小的片段,使大片段cDNA具有较高的克隆效率.所建立的文库具有较长的插入片段.合并不同长度范围的人3个月胎儿脑cDNA片段,分别克隆入文库载体,获得了长片段、中片段、短片段及合并cDNA文库.从分级文库中各随机挑取300个克隆,经载体引物PCR扩增后,测定5'末端序列,一共获得894个表达序列标签(EST)序列.根据同源性比较结果将感兴趣的克隆环化后测定全长cDNA序列,得到了12条新的全长cDNA.这些文库的建立以及新EST,cDNA的分离为文库筛选和获得脑表达的新基因奠定了基础.     

厚壳贻贝足腺cDNA文库的构建及部分EST序列分析

为获得厚壳贻贝足腺组织的EST序列标签以及可能的功能基因序列,以pCMVsport6质粒为载体构建了高质量的厚壳贻贝足腺组织cDNA文库,文库滴度为1.31×107pfu/mL,重组率为98%,平均插入片段为1.3kb.通过对文库部分克隆的序列测定,获得了11个新基因和17个功能基因,其中包括部分与厚壳贻贝足丝相关的基因.厚壳贻足腺组织cD-NA文库的成功构建为将来筛选与厚壳贻贝足丝蛋白相关的新基因,系统研究其黏附机制奠定了基础.     

硬叶兜兰花芽SSH文库的构建

以硬叶兜兰花芽cDNA为Tester,营养芽cDNA为Driver,利用SMART策略构建了硬叶兜兰花芽的抑制性消减杂交(SSH)文库.通过PCR对文库中插入的片段进行检测后,筛选了288个插入片段为500bp以上的克隆进行测序.测序结果去除载体序列后聚类得到18条差异表达片段,用BLAST进行比对分析表明,这些差异表达基因所编码的蛋白与光合作用、合成代谢、基因调控等功能有关,其中包括多个转座子和反转录转座子的同源基因.     

人基质细胞中新基因的获得及目的基因的克隆

取连续培养的骨髓基质细胞并提取其mRNA,合成cDNA后,收集＞400bp的片段,连接到真核表达载体pcDNA3.0上,构建人胎儿骨髓基质细胞真核cDNA质粒文库,并以PCR的方法从文库中扩增出编码人IL－6、SCF的基因序列,随机对文库克隆进行测序,得到了3个新基因EST,其中2个在GenBank的登录号分别为AF244998及AF244999。     

高质量匍枝根霉cDNA文库的构建及鉴定

从匍枝根霉总RNA出发纯化获得mRNA,经逆转录酶作用合成cDNA,构建高质量的cDNA文库,为快速筛选和研究匍枝根霉相关关键基因提供了基础.研究采用CHROM SPIN柱回收大于500bp的cDNA并连接pUCm-T载体,成功构建了匍枝根霉cDNA文库.鉴定结果显示:文库库容为1.95×106 cfu,文库滴度为7.84×106 cfu/mL,该文库中cDNA片段大小分布在500~4 000bp,文库重组率为96%.     

人类Neuritin cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库筛选出一条1618bp的cDNA。此cDNA含有一个426bp的最大开放阅读框,编码一个142个氨基酸的蛋白质,预测分子质量为15.3ku。与目前数据库中序列比较,该cDNA与鼠neuritin基因同源性达98％。多组织Northern blot分析显示neuritin在脑组织高度表达。neuritin cDNA的读框片段正确插入到pQE40表达载体中,获得了预期的表达产物,并初步得到了其纯化蛋白。     

对虾白斑综合症病毒P9蛋白转录水平的微阵列分析及其免疫荧光标记

从构建的对虾白斑综合症病毒cDNA文库中,我们筛选到一个拷贝数最高,编码82个氨基酸的基因(命名为p9,wsv230).该基因被克隆到pGEX-2T载体中进行GST融合蛋白的原核表达,纯化的融合蛋白GST-P9用于制备特异的多克隆抗体.利用微阵列技术和免疫荧光标记技术,对该蛋白的转录水平及其在感染细胞内的分布进行了初步研究,表明该基因为高丰度表达,推测是对虾白斑综合症病毒的一个重要基因.     

粗糙脉孢霉arg—13 cDNA能互补酿酒酵母arg11突变侏

以粗糙脉孢霉Neurospora crassa arg-13基因作为探针筛选λgt10 cDNA文库,获得全长arg-13cDNA并能表型拯救arg-13突变株,进行了arg-13cDNA测序,为了进一步证实arg-13的功能,构建了GALI诱导表达的arg-13cDNA的载体,该载体能表型互补酿酒酵母Saccharomyces cervisiae arg11突变株,证实arg-13编码线粒体内膜鸟铵酸转运酶 ,并表明酶母线粒体膜易位蛋白复合物能定位粗糙脉孢霉线粒体内膜蛋白质。     

天山雪莲PsbO基因的克隆、原核表达及其烟草中的遗传转化

从已建立的天山雪莲抗寒cDNA文库中筛选克隆了雪莲的PsbO基因,发现该基因全长1145bp,编码329个氨基酸。通过构建原核表达载体在大肠杆菌中成功获得表达,同时构建了植物表达载体,转化烟草,并获得了部分转基因植株。     

人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的利用基因重组技术在大肠杆菌中获得高效表达人过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从人cDNA文库中获得CAT编码基因,并利用pMAL-c2x构建了融合表达载体并进行了表达。结果融合表达可获得可溶性蛋白,此项研究为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。     

多重PCR技术分析日本对虾Marsupenaeus japonicus精巢和卵巢差异表达基因

通过多重PCR方法,对采用SSH(抑制消减杂交)技术制备日本对虾卵巢特异探针并筛选卵巢cDNA全长文库所获得的8个阳性克隆进行分析,研究这些新克隆的基因在精巢和卵巢的差异表达情况。这8个基因可分为二类,一类为卵巢特异表达的基因,一类为卵巢的表达量高于精巢的差异表达基因。     

秦岭蝮蛇毒的急性毒性实验研究

秦岭蝮蛇毒的急性毒性实验研究杨章民，王德林，王子浩，方荣盛（陕西师范大学实验中心陕西师范大学生物学系西安７１００６２１第一作者，男，２８岁，硕士）蜂蛇毒是以血循毒为主的混合毒，其成分非常复杂，为酶类、毒素及非蛋白物质构成的混合物，能够使动物出现一系列...     

Construction of cDNA library from iron-deficiency induced maize roots and screening and identification of iron-stress gene Fdr3

To isolate Fe-deficient related (Fdr) genes, an expression cDNA library of 4.5×105 pfu/μg has been constructed from maize roots in iron-stress. 6 clones have been screened from the cDNA library by differential hybridization screening. It is proved that an Fdr3 cDNA clone expressed stronger under iron-deficient condition than under iron-sufficient one by Northern blot and Western blot.     

Microarray-Based Differential Expression Monitoring of 79 Novel Genes in Human Fetal Tissues

0　ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＬａｒｇｅ ｓｃａｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ(ＥＳＴ)ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｌｅｄｔｏｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｕｎｄｒｅｄｓａｎｄｔｈｏｕｓａｎｄｓｏｆｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｍｉｃｒｏｂｅｓｔｏｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒｅｕｋａｒｙｏｔｅｓａｎｄｐｌａｎｔｓ[1,2 ] .ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅａｃｈｋｎｏｗｎｇｅｎｅｏｒＥＳＴｕｓｉ…     

平颏海蛇CRVP基因全长cDNA片段的克隆和序列分析

通过对平颏海蛇毒腺cDNA文库的随机测序和PCR筛选,克隆得到两种分别长为1309和1307bp的编码半胱氨酸丰富毒蛋白（cysteine-rich venom protein,CRVP）的全长cDNA序列。这两种crvp基因同源性为97％,分别编码238和199个氨基酸残基,其中包括一段相同的由19个氨基酸残基组成的信号肽。氨基酸序列分析表明,这两种CRVP蛋白与蜥蜴helothermine毒素蛋白以及台湾饭铲倩CRVP毒蛋白高度同源,而且具有半胱氨酸丰富分泌蛋白（cysteine-rich secretory protein,CRISP)家族的典型结构特征。     

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的分离和cDNA序列分析

为进一步研究扩展莫尼茨绦虫并以其作为模式生物提供基础。通过构建的扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质结构的初步预测。结果显示:获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因DAZ基因,cDNA全长1905bp,包含1个完整的ORF,编码562个氨基酸,登录号为:GH291478。蛋白理论分子量为61.3169kD,等电点为4.77,不稳定系数50.27,脂肪系数65.04,总平均亲水性-0.472。二级结构预测该蛋白有1个跨膜区域,以无规卷曲(L)为主,没有二硫键结合位点。本研究成功分离扩展莫尼茨绦虫DAZ基因。     

Construction of an improved baculovirus insecticide containing an insect-specific toxin gene

Baculoviruses provide alternatives to chemicals for controlling insect pests and can be applied by spraying. Baculoviruses have a limited host range, but work relatively slowly. They are dissolved in the midgut of insect larvae to release infectious virions which enter gut epithelial cells and begin to replicate. Replication in other organs causes extensive tissue damage and eventually death. This process can take 4-5 days, but in the field may last for more than a week, allowing the larvae to feed for longer and thereby damaging the host plant. Baculovirus expression vectors expressing foreign genes, such as those for insect-specific toxins, hormones or enzymes, might alleviate this problem. We have now constructed a recombinant baculovirus derived from Autographa californica nuclear polyhedrosis virus containing an insect-specific neurotoxin from the venom of the North African (Algerian) scorpion, Androctonus australis Hector. The neurotoxin acts by causing specific modifications to the Na+ conductance of neurons, producing a presynaptic excitatory effect leading to paralysis and death; it has no effect in mice. Expression of the neurotoxin by the virus causes a reduction in the time required to kill the host insect.     

Construction of cDNA library from iron-deficiency induced maize roots and screening and identification of iron-stress geneFdr3

To isolate Fe-deficient related (Fdr) genes, an expression cDNA library of 4.5×10⁵ pfu/μg has been constructed from maize roots in iron-stress. 6 clones have been screened from the cDNA library by differential hybridization screening. It is proved that anFdr3 cDNA clone expressed stronger under iron-deficient condition than under iron-sufficient one by Northern blot and Western blot.     

杜洛克与梅山猪大卵泡消减文库的构建

为了鉴定杜洛克猪相对于梅山猪在大卵泡中高表达的基因,本研究应用抑制性消减杂交技术成功构建了以梅山大卵泡c DNA为driver,杜洛克大卵泡c DNA为tester的消减c DNA文库。结果显示:以G3PDH和β-actin为指标检测文库的消减效率为25,从该文库中获取了350个有效的阳性克隆,PCR检测插入片段主要分布在150-750 bp。克隆测序得到74个有效的EST序列,GO分析表明主要与细胞信号、细胞结构、代谢、细胞分化、基因/蛋白质合成、细胞组织防护等功能相关。利用q PCR技术验证了ELTD1、Grb14、SNRPE、CSDE1、ALDH18A1、e IF4E、BMPR-IB等基因在梅山和杜洛克大卵泡中的表达模式。结果发现在两猪种的大卵泡间存在显著性差异。本研究有助于揭示影响猪卵泡发育和生殖数量控制的分子基础。