高等真菌LMPQ39基因文库的构建

以噬菌体λＥＭＢＬ３ＤＮＡ为载体，用ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ双切酶切后，与Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切的１０－２１ｋｂＤＮＡ片段连接，体外包装，感染Ｅ·ｃｏｌｉＬＥ３９２，所得重组子数为２．２１×１０４ｐｆｕ，超过建库所需的理论值．随机挑选的１４个克隆子，其ＤＮＡ用ＢａｍＨＩ酶切，有９个出现了不同于载体ＤＮＡ的酶切带型．     

钝齿棒杆菌YL1基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌…

以ｐＵＣ１９质粒为载体建立了异亮氨酸产生菌钝齿棒杆菌ＹＬ１的基因文库，并通过酶切重组子、斑点杂交得到证实，区筛选５８００个重组子，一个特定ＤＮＡ片断在库中存在的可靠性达９９．０９％。从中克隆重组了带有ｉｌｖＡ基因片断的重组质粒ｐＹ１９４转化ＡＨＶ的大肠杆菌ＥＤ８６５４５，使本来不产Ｉｌｅ的大肠杆菌可以积累Ｉｌｅ１．５ｇ／Ｌ，为进一步高效表达构建工程菌创造了条件。     

普通小麦T型CMS保持系mtDNA基因文库的构建

研究证明，小麦细胞质雄性不育（CytoplasmicMaleSterile，CMS）与mtDNA有密切的关系．因此，构建保持系线粒体DNA的基因文库应该有助于发现“育性”基因，进一步研究细胞质雄性不育的不育机理及创建工程恢复系，推进小麦杂种优势利用的进程．本文以普通小麦（T．aestivum）T型CMS细胞质雄性不育系75－3369A及其保持系75－3369B为材料，构建了保持系线粒体DNA基因文库，并应用保持系线粒体基因文库的部分重组子转化相应不育系，探讨保持系线粒体DNA与育性恢复的关系．线粒体DNA提取于75－3369B的黄化苗，经测定纯度适合于构建基…     

水稻农虎26B保持系线粒体基因文库的构建

经Sau3AI部分酶解并脱磷的水稻农虎26B保持系的线粒体DNA与BamHI/EcoRI双酶切的λEMBL3AB载体DNA进行了连接,对连接物进行了体外包装,并感染NM538和Q359受体菌,得到了1.75×10~4个重组子.从中随机选取5个克隆的DNA,用BamHI进行酶切,琼脂糖凝胶电泳,出现了不同于载体DNA的酶切带型.另随机选取3个克隆的DNA,均与水稻线粒体DNA发生了杂交.由此认为,水稻农虎26B保持系线粒体基因文库确已建立.     

钝齿棒杆菌YL_1基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌中的克隆表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体建立了异亮氨酸产生菌钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｍｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）ＹＬｌ的基因文库，并通过酶切重组子、斑点杂交得到证实．共筛选５８００个重组子，一个特定ＤＮＡ片断在库中存在的可靠性达９９．９９％．从中克隆重组了带有ｉｌｖＡ基因片断的重组质粒ｐＹＩ９４，转化ＡＨＶ的大肠杆菌ＥＤ８６５４－５，使本来不产Ｉｌｅ的大肠杆菌可以积累Ｉｌｅ１．５ｇ／Ｌ，为进一步高效表达构建工程菌创造了条件．     

氧化亚铁硫杆菌Tf-55基因文库的构建

以λEMBL_3噬菌体 DNA作为载体,用BamHI/EcoRI双酶切后,与Sau3AI部分酶切的氧化亚铁硫杆菌Tf-55染色体10～23Kb DNA片段连接,体外包装成重组噬菌体,所得重组子为6×10~4Pfu(噬菌斑形成单位)达到了建库要求的理论值。并用酶切分析及分子杂交的方法对该库进行了验证。     

普通生酮基古龙酸菌S2基因文库的构建和筛选

在Vc生产的第2步发酵中,普通生酮基古龙酸菌S2能利用醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为Vc的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG).对普通生酮基古龙酸菌S2基因组DNA进行部分酶切,与黏粒载体pKC505连接后,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5α,构建成普通生酮基古龙酸菌S2基因组文库,得到12 000余个转化子.再利用纯化的醇醛脱氢酶免疫家兔制备出合格抗血清,应用免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)对文库进行筛选,获得1个阳性克隆K719#.通过检测此基因工程菌的活性,表明在添加辅酶PQQ后,K719#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中得到了表达,这为简化Vc的生产工艺奠定了基础.     

地衣芽孢杆菌基因文库的构建及分析

作为一种高效无毒、无二次污染以及能够生物降解的水处理剂,生物絮凝剂受到越来越多的关注.以一株具有强絮凝活性地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为实验菌,通过构建基因组文库,尝试筛选絮凝基因阳性克隆子.结果表明,该菌株基因文库构建成功,共得到2.1×103克隆子.随机挑取17个阳性克隆子进行DNA测序分析,发现一些相对保守蛋白及2个不具有明确功能的基因.该结果为进一步研究地衣芽孢杆菌全基因组结构功能及细菌絮凝基因奠定了基础.     

黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。     

极端嗜热厌氧纤维素分解菌基因文库的构建及其内切葡聚糖酶基因片段的克隆

以从云南邦拿掌温泉中分离、纯化的高温厌氧纤维素分解菌邦2菌(Cadicellulosiruptor)为材料,制备其总DNA,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ部分酶切后,在T4DNA连接酶的作用下与经EcoRⅠ完全酶切、去磷酸化的质粒载体pUC18连接,然后转化E.coliJM109,建立了邦2的基因文库,经筛选鉴定得到6.3×103个重组子;重组子经刚果红平板验证:约有23.5%菌落呈现透明圈;重组子经EcoRⅠ酶切验证显示:重组质粒均含有外源DNA插入片段.结果表明已克隆到邦2菌纤维素酶系中的内切葡聚糖酶基因(ED基因)片段.     

兔血清制备及兔来源细胞培养实验

目的制备兔血清,用于兔来源细胞的培养。方法通过兔股动脉采血,4℃冷藏过夜后析出血清。分别比较含10%兔血清和10%胎牛血清的DMEM培养液中细胞形态和增殖性能及冻存存活率。结果使用兔血清培养细胞分裂指数约为1%~2%,冻存存活率为90%;使用胎牛血清细胞分裂指数约为0.5%;细胞冻存存活率为85%。结论兔血清制备方法简便易行,所获兔血清对兔来源的细胞在增殖性能和冻存存活率方面均优于胎牛血清,适宜兔源组织的培养。     

巴西橡胶树基因组文库的构建

用改良 CTAB 法提取巴西橡胶树幼嫩叶片总 DNA,通过限制性内切酶 Sau3A 不完全酶切,回收并纯化后得到15～23 kb 的 DNA 片段。以来源于λ噬菌体的 EMBL3为载体 DNA,用T_4DNA 连接酶将载体与 DNA 片段连接成为重组 DNA。经体外包装形成完整的噬菌体颗粒,转染受体菌E.coli LE392,在 LB 平板培养基上获得重组子的效率为1.1×10~6个/μg DNA,达到构建文库的要求。随机挑取一定数量的克隆子,酶切分析结果发现有88%的克隆子携带外源 DNA。     

兔生长激素cDNA克隆和表达

从兔脑下垂体中的mRNA中,利用合成引物逆转录PCR,获得了前体和成熟生长激素的cDNA,成熟生长激素的cDNA克隆在pET-3a表达载体并转化到大肠杆菌BL21(DE3 plys)中,获得了高效表达,表达量达到大肠杆菌总蛋白的40%。     

浅谈高校图书馆对大学生信息素养的影响

在当今社会中大学生所具备的信息素养,直接影响到他们是否能对获取的信息进行有效的吸取、处理和再创造。高校图书馆在培养大学生信息素养方面具有独特的优势。本文阐述了信息素养的涵义,根据目前大学生的信息素养状况,提出了应加强培养信息素养的目标以及要充分利用图书馆的优势对大学生进行信息素养教育。     

花生根瘤菌基因组文库的构建

以具有高吸Ｈ２活性的花生根瘤菌Ｌ８－３为出发菌株提取总ＤＮＡ，经ＢａｍＨＩ不完全酶切后，获得２０ｋｂ左右的ＤＮＡ片段，按Ｉｓｈ－Ｈｏｒｏｗｉｃｚ和Ｂｕｒｋｅ方法，与具有多克隆位点的ＣｏｓｍｉｄｐＬＡＦＲ３克隆载体连接，经体外包装、转导Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１，在选择培养基平板上获得１万多个重组克隆子．随机挑选２２个克隆子进行分析，其中１９个克隆子携带外源ＤＮＡ片段，平均长度为２１．４ｋｂ，文库有效克隆子数和插入ＤＮＡ片段均达到建库要求．ＰＣＲ筛选和生物素探针杂交初步结果显示，重组质粒中所携带的外源ＤＮＡ可能含有我们所需的吸Ｈ２基因．