微注射MT-hGH融合基因后小鼠原核卵体外发育和移植的研究

将MT-hGH(小鼠金属巯因启动子--人生长激素基因)融合基因,用微注射的方法注入昆明白小鼠原核卵的雄原核中,观察注射外源基因对原核卵的存活,卵裂及2细胞胚胎体外发育的影响。实验结果表明,昆明白小鼠原核卵在雄原核内注射2p1 MT-hGH基因悬液后存活率为86.71％,其存活率与只穿刺雄原核不注射:注射培养液;注射TE缓衡液后存活率相近(分别为84.94％,84.4％和86.42％)。基因注射后原核卵存活率降低主要由注射针机械刺激引起的。原核卵在注射MT-hGH基因后注射胚卵裂率显著降低,以培养24h统计。注射培养液组活胚卵裂率为93.98％,丽注射基因组仅为87.96％(P<0.01)。注射MT-hGH基因组在体外培养条件下,2细胞到胚泡的发育率为40.66％,而注射培养液的对照组为64.09％(P<0.05)。注射基因组胚胎发育速度延缓,部分胚胎延缓12h。将基因注射后的原核卵经体外培养形成的198枚2细胞胚。45枚桑椹胚和161枚胚泡,移植给54只假孕受体,其中16只受体妊娠,产仔49只。目前存活25只。85日龄时。有6只小鼠体重为对照组平均体重的1.207～1.353倍,生长速度较快。经检测其中有5只呈阳性反应为转基因小鼠。     

小鼠精子微注射受精卵的体外发育与移植的研究

用显微注射方法,将精子注入小鼠卵母细胞卵周隙中,使精卵体外受精获得受精卵。并对精子注射后卵母细胞的成活率、受精率和受精卵的发育率以及移植后受胎率等方面进行了系统的研究,结果表明:卵子存活率为75.36％(1309/1737),其中264枚卵裂,受精率为20·17％(264/1309),卵裂卵经体外培养后有192枚发育到桑椹胚及胚泡期,发育率为72.73％(192/264)。将其中73枚(桑椹胚10枚,肛泡63枚)胚胎移植到10只假孕受体子宫中,一只受体妊娠产仔9只,仔鼠发育正常。     

MT—hGH基因注入小鼠受精卵的研究

用显微注射法，将MT－hGH融合基因注入昆明白小鼠受精卵雄原核中，受注的原核卵经体外培养发育的198枚2细胞胚、45枚桑椹胚和161枚胚泡，移植到54只假孕受体，其中16只妊娠产仔只，存活到供试的仔鼠25只，小鼠长到3个月后，切尾制备DNA，经DNA斑点杂交和Southern印迹杂交检测基因整合情况，25只小鼠中3只有融合基因整合，称为转基因小鼠，仔鼠21日龄离乳后饮水中加入锌（Za^ )，以诱导融合基因表达，85日龄时，转基因小鼠体重比对照组重32．0％，还讨论了基因整合方式对胚胎发育的影响。     

绵羊体外成熟,体外受精卵的体外发育及移植后的产羔

体外成熟、体外受精后的绵羊卵在体外长期培养或在2～4细胞期和桑堪～囊胚期移植给受体母羊,观察了培养卵的发育和移植后的受胎率。方法是将采自屠宰场的绵羊卵巢在1～12小时内带回实验室,抽取卵母细胞。从中选取卵丘细胞层完整的卵子,在二氧化碳培养箱内,用含有10％NSS(或FCS)、hCG和E_2,并以Hepes缓冲的M199培养24～26小时。再用以IonophoreA23187诱导获能处理过的新鲜公羊精于进行体外受精.7～10小时后移入发育培养基,即含有10％FCS(或NSS)和丙酮酸钠的Hepes缓冲的M199内继续培养,受精后将部分发育为2～4细胞胚和桑堪～囊胚期胚手术移植给受体母羊。另一部分卵子则在受精后48～72小时的不同时间内统计其卵裂卵的出现率,并继续培养7～12天详细观察卵裂卵的发育情况。在受精后48～72小时卵裂卵的出现率,FCS和NSS组分别为39.6％145/366)和52.4％(182/347),前者显著低于后者;将61枚2～4细胞期胚和桑椹～囊胚期胚分别移植给20只受体母羊,有10只受胎。共产羔11只,受胎率为50％;在发育培养液内继续培养的482枚卵裂卵中有312枚(64.7％)发育为桑椹～囊胚期胚(其中包括部分孵化囊胚)。     

原核显微注射产生转基因绵羊胚胎

体外采集绵羊卵丘卵母细胞复合体,成熟培养24 h,经过体外受精培养17 h,比较高速离心对胚胎发育的影响;高速离心可以使黑色脂滴甩到一边从而使受精卵原核清晰可见.然后将绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子和真核细胞表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)的载体DNA显微注射于绵羊受精卵雄原核中,并将异构胚在SOF液中发育培养.结果表明:高速离心组囊胚率低于对照组,但是没有显著性差异(P》0.05);显微注射外源基因2天后在激光共聚焦显微镜下可见荧光胚胎;PCR检测5个荧光胚胎均可见特异性条带.在原核显微注射生产转基因胚胎中,绿色荧光蛋白可作为标记基因进行早期胚胎筛选,为提高转基因动物移植效率奠定实验基础.     

不同状态的牛供核细胞对核移植胚胎发育的影响

比较了不同状态的牛供核细胞对核移植胚胎发育的影响．结果表明：体外培养2-5,6—10,11—15,16v20代的供核细胞的融合率和卵裂率没有差异,但随着体外培养代数的增加,重构卵发育到囊胚的比例下降．16—20代供核细胞组的囊胚率显著低于2—5和6—10代供核细胞组的囊胚率（分别为19．61％,26．67％和28．57％,P〈0．05）;来源于原代牛（G0）,克隆一代牛（G1）和克隆二代牛（G2）的供核细胞的融合率,卵裂率和囊胚率没有明显差异;对于新鲜供核细胞和冷冻供核细胞,胞质内注射法的重构卵率要明显高于透明带下注射法的重构卵率（分别为81．31％,67．96％和82．08％,52．94％,P〈0．05）,但各组重构卵的卵裂率和囊胚率没有差异,冷冻供核细胞结合胞质内注射法可以获得较好的核移植胚胎发育．     

卵细胞体外成熟(IVM)在小鼠生物净化中的应用

目的 在小鼠生物净化中,从超排后未排卵的卵巢,取卵泡内未成熟卵采用卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)使之在体外成熟并具备受精能力,以提高卵子利用率和作为常规促超排失败的一种补救措施。方法 在小鼠生物净化中,取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢,在实体显微镜下划破卵泡挑选卵丘卵母细胞复合物(COCs),置于成熟液滴中在体外发育成熟。同时以注射PMSG和HCG后正常超排卵、只注射PMSG后取未成熟卵体外成熟和注射PMSG和HCG后取疑似成熟卵和裸卵体外成熟作为对照。经体外受精、体外胚胎发育后,将2-细胞胚移植到受体输卵管,使其在受体内发育成为成熟的个体。结果 注射PMSG和HCG后未排卵组(A组),卵细胞体外成熟率为87.0%±3.2%,二胞率为55.1%±12.3%,囊胚率为23.1%,移植41枚二细胞胚至2只受体鼠,出生5只幼崽,产仔率12.2%。只注射PMSG,48 h后取未成熟卵组(B组),体外成熟率为83.9%±3.9%,二胞率为51.8%±9.3%,囊胚率为38.5%±13.9%。注射PMSG和HCG正常超排组(C组),其二胞率为78.9%±0.6%,囊胚率为78.0%±3.8%。注射PMSG和HCG未排卵卵巢,取裸卵和疑似成熟卵(D组),体外成熟培养0 h,6 h和16～18 h,其成熟率、二胞率和囊胚率与其它三组相比均较低且有极显著性差异。A组和B组与正常对照C组相比,二胞率均有显著性差异,囊胚率均有极显著性差异。结论 卵母细胞体外成熟(IVM)可以作为小鼠生物净化中促超排失败的一种补救措施,并且可以提高珍稀品系小鼠的卵子利用率。     

生长因子对牛体外受精卵体外发育的影响

本研究探讨了在成熟培养液和发育培养液内添加ＥＧＦ和ＴＧＦ－α对牛体外受精卵发育的影响，在成熟培养液内分别添加ＥＧＦ和ＴＧＦ－α，经体外受精处理后卵裂率分别为７８．３％和８２．６％，显著高于对照组６０．２％的卵裂率；三个处理组囊胚发育率分别为１９．６％、２４．５％和１８．７％，三者间无显著差异．在发育培养液内分别添加ＥＧＦ和ＴＧＦ－α，其囊胚发育率分别为３０．０％和２３．４％，与对照组２１．０％的囊胚发育率相比差异不显著．在成熟培养液内添加ＴＧＦ－α，在发育培养液内添加ＥＧＦ，经这两种生长因子分别作用后，体外受精卵翼胚发育率为２１．０％，与单独使用其中一种生长因子相比囊胚发育率无明显提高．     

细胞松弛素B、温度、离心处理对猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻的影响

主要探讨使用CB预处理和不同温度冷冻保护剂对猪卵母细OPS玻璃化冷冻保存的影响,并对使用不同温度冷冻保护剂下,探讨离心猪卵母细胞后的OPS冷冻、解冻的效果.结果表明,体外成熟培养12h后,将经7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)处理的猪卵母细胞进行OPS玻璃化冷冻保存.解冻后继续体外成熟培养,猪卵母细胞的形态正常率和成熟率与对照组无显著差异(P>0.05),但是与对照组相比,经冷冻前经CB预处理的卵母细胞其体外受精胚胎的卵裂率、桑葚胚和囊胚率显著提高(P<0.05).此外,使用预平衡至39℃的冷冻保护剂能够达到较好的解冻效果,卵母细胞成熟率较高,但离心并没有促进冷冻后猪卵母细胞体外受精胚胎发育率.     

羔山羊的超数排卵及体外受精

以ＦＳＨ或ＦＳＨ－ＬＨ四种不同处理方法对２９只６８～１１０日龄羔山羊进行超排处理，结果共采集卵泡卵母细胞７０８枚，平均每只羔羊采卵２４．４枚．卵母细胞经体外培养２４ｈ后有８１．２％的卵发育为成熟卵．分别用经钙离子载体Ａ＿（２３１７８）或肝素进行获能处理的精子对体外培养成熟的卵子进行体外受精，结果精子穿入卵率分别为５４．８％和３４．４％，发育至２～４细胞胚的卵裂率分别为２８．６％和４１．９％．采用ＦＳＨ－ＬＨ（肌注）进行超排处理得到的卵子经体外受精处理后，其卵裂率明显高于采用其它超排方法得到卵子的卵裂率．     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

关于小鼠显微注射体外受精及受精卵体外发育和移植的研究

用显微注射技术将精子(或精核)注入卵周隙(或卵细胞质)使卵受精,是近十年来生殖生物学基础研究的新途径,用此方法进行体外受精,可克服因免疫因素、精子寡少、精子弱动等因素造成的不孕症,九十年代初国外将此方法用于人类临床上已获得成功。本研究以昆明小白鼠为实验对象,通过精子显微注射方法完成体外受精,并对显微受精卵的存活率、受精卵体外培养的卵裂率、发育率及发育胚胎的移植进行了系统的研究,并获得由微注射精子体外受精卵发育而成的后代。     

卵母细胞老化对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

就小鼠卵母细胞的卵龄对克隆胚的体外发育能力的影响进行了检测,以确定最佳的取卵时间,以及取卵后进行核移植操作的可耐受的时间。采用PMSG和hCG超排B6D2F1雌鼠。在体内老化实验中,分别于注射hCG后13,15,17,20h取卵用于核移植操作;在体外老化实验中,所有的卵均于注射hCG后13h取出并培养,然后在13,15,17,20h进行核移植操作。每个时间点的核移植操作在1h内完成,重构的胚胎培养1h后进行激活。结果显示:在体内老化实验中,注射hCG后13h取卵,获得的克隆囊胚发育率最高,为56.0%,15h取卵仍维持了其支持胚胎体外发育的能力,但17h及更长时间后取的卵,重构后的囊胚发育率显著下降(18.1%)。注射hCG后15h取的卵孤雌发育率最高(囊胚发育率为90.1%),并在17h仍维持较高的孤雌发育能力,在20h显著下降。在体外老化试验中,于注射hCG后13h取卵,分别于13,15,17h重构,都获得了较高的囊胚发育率(分别为57.7%,52.2%,46.3%),而在注射hCG后20h重构,囊胚发育率显著下降(14.8%)。体外老化的孤雌胚在注射hCG后22h激活时囊胚发育率显著下降。结果表明:卵母细胞在体内和体外老化都影响克隆胚的体外发育,最佳取卵时间为注射hCG后13h,取卵后立即用于重构可获得最佳囊胚发育率;体内、外老化卵支持重构胚较好发育的时间间隔是不同的,体内老化卵支持重构胚发育能力从注射hCG后17h开始下降,体外老化卵则发生在20h。这些结果可以指导操作,有利于在应用核移植进行其他基础研究时降低操作引起的误差。     

外源褪黑素对羔羊卵母细胞成熟及卵丘扩展相关基因表达的影响

目的 本研究旨在探究在羔羊卵母细胞体外成熟培养过程中,添加外源褪黑素对羔羊体外受精胚胎发育质量以及卵丘扩展相关基因表达的影响.方法 在成熟培养液中添加不同浓度(0,10,25和50μg/L)的褪黑激素,研究外源褪黑素对羔羊体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚DNA核碎片化的影响,通过DCFH-DA染色检测卵母细胞中活性氧...     

产生乳腺定位表达人CD14的转基因小鼠研究

将来自ＰＣＲ法合成的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’端８９８ｂｐ上游区和人单核细胞表面分化抗原基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ片段构建的ＢＬＧ－ｈＣＤ１４融合基因纯化后,注入小鼠受精卵原核。实验共注射受精卵１１４９枚,经体外培养发育到２－细胞期的胚胎计９６８枚,发育率为８４．２％。从发育的胚胎中选择６３４枚移植到４６只假孕受体。其中１４只妊娠产仔,妊娠率３０．４％。妊娠受体共移植胚移２０７枚     

屠宰母牛卵巢卵母细胞的体外受精与早期发生

将采自屠宰母牛卵巢的未成熟卵子在含有促性腺激素和牛血清的TCM199或Ham'sF10内培养成熟后,再用以钙离子载体Ionophore A23187诱导获能的牛新鲜或冷冻精子进行授精处理,6～7小时后移入发育用培养液,即含有牛血清及丙酮酸钠的M199或Ham's F10内继续培养。在授精48小时及60～96小时后分别统计了培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率。在部分实验中把发育为4～8细胞期的胚移入经假孕处理过的母兔输印管内培养4～5天或者在原发育培养液内继续培养5～8天之后观察了桑椹胚、囊胚的出现率。结果是培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率分别达92.0～97.8％和62.5～67.6％,移入兔输卵管内和在体外条件下继续培养的卵子中分别有3.7～30.8％和4.3～31.0％(发育为外形正常的桑椹胚～囊胚期胚胎(包括扩张囊■及■化囊胚)。     

胚胎的培养液平均拥有量和单独或群体培养对牛体外受精胚胎发育的影响

采用化学成分明确的培养系统,研究了胚胎的培养液平均拥有量以及单独或群体培养对牛IVF卵体外发育的影响.将牛体外受精(IVF)卵分别以每100、50和20μl培养液小滴内10枚卵子的形式进行发育培养,三个处理组的囊胚发育率分别为:6.0%、9.4%和14.3%,三者间无显著差异.在此基础上,选择培养效果较好的每枚胚胎2μl的培养液量,分别在20、10、4、2μl小滴内培养10、5、2、1枚胚胎,四个组的囊胚发育率分别为:10.0%、16.4%、10.0%、4.0%,5枚胚胎/10μl小滴处理组的囊胚率显著高于1枚胚胎/2μl处理组(p<0.05).研究结果表明:不同培养液拥有量以及单独或群体培养都可支持部分胚胎发育至囊胚阶段,降低培养液体积和群体培养更有助于牛IVF卵的体外发育.     

兔胚胎在不同培养液中体外发育的比较

本试验对比兔2细胞胚胎在三种培养液中体外培养144h后的发育状况。三种培养液分别为：加小牛血清的A组M199培养液、加牛白蛋白5片段的B组M199培养液和加胰岛素、转铁蛋白及谷氨酰胺的C组M199培养液。从发育速度看,A组和B组比C组的胚胎发育快;从发育效果看,发育到囊胚和孵化囊胚的比例,A、B、C三组分别为77．0％、64．8％及7．0％。这两方面结果都说明A、B组培养效果接近,C组的培养效果较差。试验结果表明,B组培养液是研究影响兔胚胎发育因素的适宜培养液。     

灭活与未灭活发情母牛血清对牛体外受精卵发育的影响

通过在成熟培养液和发育培养液内添加灭活或未灭活发情母牛血清（ＯＣＳ）探讨了血清灭活与否对牛体外受精（ＢＩＶＦ）卵发育的影响，在卵母细胞成熟培养实验中，两个组分别添加１０％灭活、未灭活发情零日母牛血清（Ｄ＿０ＯＣＳ），另一组为不加血清的对照组。三个处理组的卵裂率分别为７４．８％、７６．５％和５０．２％（Ｐ＜０．０１）。囊胚发育率分别为２５．９％、１８．３％和４．８％（Ｐ＜０．０５）。前两个处理组间无显著差异，但二者的各项发育指标均显著高于对照组。在发育培养液内分别添加５％灭活或未灭活发情第五日母牛血清（Ｄ＿５ＯＣＳ）。两个处理组的卵裂率分别为７６．７％和７２．０％，囊胚发育率分别为２４．５％和２０．１％，二者间无显著差异，结果表明：牛卵母细胞的成熟过程中，血清的添加是必须的。未灭活ＯＣＳ同样可以促进ＢＩＶＦ卵的体外发育，但其效果仍不如灭活的ＯＣＳ．     

牛细胞核移植试验初报

体外成熟培养（ＩＶＭ）２３－２４ｈ的牛卵母细胞，去核后用８０Ｖ／ｍｍ，４０μｓ电激活２次（Ｉ组）或不激活（Ⅱ组），然后注入８－３２细胞期体外受精（ＩＶＦ）牛胚胎的卵裂球，再用８０－１００Ｖ／ｍｍ，４０μｓ电激两次诱导卵母细胞与卵裂球融合，两组的融合率（６２．８％与６５．１％）和卵裂率（５５．４％与５１．９％）无显著差异（Ｐ〉０．０５）。全部４１２枚重组卵电激后的融合率是６３．８％（２６３／４１２）