基于斑马鱼模型的海洋中药厚藤安全性评价

采用模式生物斑马鱼模型评价海洋中药厚藤水提物（Ipomoea pes-caprae（Linn.） Sweet water extract,IWE）及醇提物（Ipomoea pes-caprae（Linn.） Sweet alcohol extract,IAE）的安全性。采用受精后3 dpf （Day post fertilization） AB系斑马鱼进行急性毒性评价,将受精后10 hpf （Hours post fertilization）斑马鱼用于胚胎发育毒性及心脏毒性评价;将受精后3 dpf的gz15Tg/+（AB）肝脏荧光蛋白转基因斑马鱼用于肝脏毒性评价。结果表明,急性毒性实验中厚藤水提物半数致死浓度（LC₅₀）为2.84 mg/mL,10%致死浓度（LC₁₀）为1.46 mg/mL;厚藤醇提物LC₅₀为1.32 mg/mL,LC₁₀为0.76 mg/mL。胚胎发育毒性实验中厚藤水提物最大非致死浓度（MNLC）组及LC₁₀组干预24 h对斑马鱼胚胎未见尾部自主运动现象且发育迟缓,斑马鱼发育至72 hpf出现心脏和软黄囊肿大现象;厚藤醇提物LC₁₀组与空白对照组比较出现心包水肿,血瘀,观察中各组未见胚胎发育畸形现象。心脏毒性实验中空白对照组斑马鱼胚胎心跳节律规则、搏动强有力;厚藤水提物及醇提物在24 hpf,48 hpf,72 hpf时间点1/3MNLC组、MNLC组及LC₁₀组分别与空白对照组比较,均能明显减慢斑马鱼胚胎的心率且呈现剂量依赖性（P<0.01）;厚藤水提物及醇提物1/3MNLC组、MNLC组及LC₁₀组分别与空白对照组比较,均能明显增加斑马鱼胚胎的SV-BA间距（P<0.01）。肝脏毒性实验中厚藤水提物中各给药组与空白对照组比较,肝脏荧光面积均有减少趋势,组间比较无差异性;厚藤醇提物中1/3MNLC组、MNLC组及LC₁₀组与空白对照组比较,肝脏荧光面积均有增加趋势,但组间比较无差异性,各给药组斑马鱼的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平与空白对照组比较均无显著差异。本实验中厚藤水提物的LC₅₀显著高于醇提物。高剂量LC₁₀组均对斑马鱼胚胎发育产生一定毒性作用。厚藤水提物及醇提物随着给药剂量增加,明显减慢斑马鱼胚胎的心率,产生一定心脏毒性作用。厚藤水提物及醇提物均未引起明显的肝脏毒性。     

金花茶叶醇提物对LPS导致RAW炎症的保护作用

考察金花茶叶醇提物对内毒素(LPS)刺激腹腔巨噬细胞(RAW264.7)后细胞炎症的保护作用.通过噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度金花茶叶醇提物作用下细胞的存活率;通过Griess法检测金花茶叶醇提物对LPS刺激后RAW264.7细胞NO释放量;通过酶联免疫吸附法检测炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6含量;通过蛋白免疫印迹法检测NF-κB p65的表达量.MTT结果显示,LPS及不同浓度的金花茶叶醇提物均未对细胞存活率产生明显影响(P0.05).3、10、30、100μmol/L的金花茶叶醇提物均可以明显减少LPS诱导的RAW264.7细胞NO的释放(P0.05).100μmol/L的金花茶叶醇提物可以明显减少LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的释放(P0.001).10、30、100μmol/L的金花茶叶醇提物均可以明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB p65蛋白表达(P0.05).金花茶叶提取物对内毒素导致的腹腔巨噬细胞炎症具有一定的保护作用,其作用机制可能与NF-κB通路相关.     

常山碱盐斑马鱼胃肠道毒性及其评价

为了分析常山碱盐的胃肠道毒性,并探寻适合此类毒性药物的模式动物,以斑马鱼为研究对象,测定常山碱盐对斑马鱼的10%致死浓度（LC10,以质量浓度计）和最大非致死浓度（MNLC,以质量浓度计）,并应用斑马鱼肠蠕动抑制作用评价模型对常山碱盐的肠道毒性作用进行评价,包括肠蠕动抑制评价、肠道表型和肠道病理组织学观察.结果表明,常山碱盐对斑马鱼的LC10和MNLC约为10 mg/L和5 mg/L.在0.50,1.67,5.00,10.00 mg/L质量浓度常山碱盐处理条件下,斑马鱼肠道内容物含量明显增加,肠蠕动抑制率分别为27.78%,61.11%,77.11%,80.89%,常山碱盐对斑马鱼肠蠕动有较明显的抑制作用.肠道毒性表型和病理组织学观察发现,在0.50,1.67,5.00,10.00 mg/L质量浓度常山碱盐处理条件下,斑马鱼肠道褶皱减少或消失,肠道黏膜细胞变性,肠道黏膜破坏,肠腔模糊,肠腔变窄,且严重程度和发生率与常山碱盐质量浓度呈较明显的正相关性.常山碱盐存在明确的胃肠道毒性,斑马鱼可作为模式动物应用于消化道毒性药物的致毒作用研究.     

ND3、NF-κB在遗传性糖尿病长爪沙鼠肝脏、肾脏中的表达定位

的 比较正常血糖长爪沙鼠和自发遗传性糖尿病长爪沙鼠肝脏和肾脏组织中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位3(NADH dehydrogenase 3,ND3)和核转录因子κb(nuclear factor κB,NF-κB)蛋白的表达定位差异。方法 选取正常血糖长爪沙鼠和自发遗传性糖尿病长爪沙鼠各6只,分别采集动物的肝脏和肾脏组织,利用免疫组织化学检测ND3、NF-κB在各组织中的定位和表达水平。结果 ND3、NF-κB表达于长爪沙鼠肝脏实质细胞胞质中,与对照动物相比,糖尿病长爪沙鼠肝脏中NF-κB表达显著升高;ND3还表达于长爪沙鼠肾脏肾小管上皮细胞胞质中,且与对照动物相比,糖尿病长爪沙鼠肾脏中ND3表达显著升高。结论 在糖尿病长爪沙鼠中,ND3显著高表达于肾脏肾小管上皮细胞,NF-κB显著高表达于肝实质细胞,提示肾脏中ND3和肝脏中NF-κB的异常升高可能参与长爪沙鼠糖尿病的发生和发展。     

铬对鲤鱼非特异性免疫功能的影响

用0.1,0.5,0.8,1.0和2.0mg/L铬溶液分别刺激鲤鱼21d和44d后，测定鲤鱼非特异性免疫指标，估测不同浓度的铬溶液对鲤鱼非特异性免疫指标的影响。0.1和0.5mg/L铬溶液对鲤鱼NBT阳性细胞、溶菌酶活性无影响，0.8mg/L的铬溶液可使NBT阳细胞数和溶菌酶活性降低，而1.0和2.0mg/L铬溶液可使NBT阳细胞数和溶菌酶活性显著下降（P＜0.05)。这一结果表明水体中0.1和0.5mg/L铬对鲤鱼的非特异性免疫功能无影响，0.8mg/L的铬略有影响，而1.0和2.0mg/L的铬则明显降低鲤鱼的非特异性免疫功能。     

广西莪术水提物对卵形鲳鲹细胞免疫力的影响

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国重要的海水养殖鱼类,经济价值极高,但近年来各种鱼病频繁爆发造成了巨大损失。为探究广西莪术(Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang)水提物对卵形鲳鲹免疫力的影响,本文在细胞水平上,利用卵形鲳鲹肾脏组织细胞系研究广西莪术水提物的细胞毒性,以确定其细胞安全浓度。然后利用卵形鲳鲹细胞系研究广西莪术水提物对总一氧化氮合酶(T-NOS)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶等卵形鲳鲹细胞免疫相关酶的影响。结果表明,广西莪术水提物的细胞安全浓度为≤5mg/mL,广西莪术水提物对卵形鲳鲹细胞的免疫相关酶活力(总一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶)有明显促进作用。广西莪术有潜力发展成为一种高效的水产免疫增强剂,并且基于传统壮药积极开展绿色无药物残留的新型抗水产病害中药制剂的研究,对于促进水产养殖业持续健康发展,确保水产品质量和食品安全意义重大。     

水体铜对鲤肠道菌群结构及免疫力的影响

为了解水体重金属铜对鲤肠道菌群多样性、结构及免疫力的影响,以不同质量浓度的水体铜胁迫鲤56d,对鲤肠道菌群α多样性、β多样性、基于属水平的群落组成结构及肠道免疫调控因子和紧密连接蛋白的基因表达进行了分析.结果显示,0.14mg·L-1、0.28mg·L-1处理组与对照组相比,α多样性指数有显著性下降(P0.01),主成分分析(PCA)显示两处理组与对照组群落组成区分明显,优势菌群发生明显变化;同时,两处理组肠道免疫调控因子Il-1β,IL-8,TNF-α及信号分子NF-κB基因表达有显著增加(P0.01),肠道紧密连接蛋白Claudin-3,Claudin-c及免疫调控因子IL-10、信号分子TOR基因表达有显著下降(P0.01).结果表明:中、高质量浓度水体铜胁迫显著降低了鲤肠道菌群的多样性,改变了结构组成,对鲤肠道上皮免疫屏障造成了损伤.     

镉对斑马鱼卵巢的毒性效应和子代响应

为探讨重金属镉慢性暴露对斑马鱼卵巢的毒性效应及子代响应,将斑马鱼暴露于0,0.062,0.124,0.248,0.620,1.240 mg/L 6个镉体积质量.暴露21 d后,以脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量、卵巢组织超氧化物歧化酶(SOD)水平、过氧化氢酶(CAT)水平为终点评价慢性镉暴露对斑马鱼卵巢的毒性效应;以子代受精率、孵化率和96 h幼鱼体长为终点评价慢性镉暴露下斑马鱼的子代响应.结果表明:MDA含量随镉浓度的增加而显著升高,抗氧化防御体系被抑制.当ρ(Cd)≥0.248 mg/L时,子代的受精率和孵化率显著降低;当ρ(Cd)≥1.240 mg/L时,斑马鱼不育;当ρ(Cd)≥0.620 mg/L时,子代斑马鱼孵化失败.孵化成功后的幼鱼96 h体长随镉浓度的增加而显著降低.     

重铬酸钾对斑马鱼的急性毒性及组织过氧化氢酶活性的影响

为研究Cr6+单一毒性对斑马鱼的毒性安全评价,选择重铬酸钾进行急性毒性试验,观察斑马鱼在染毒3~96h的症状,以半数致死浓度(LC50)判断重铬酸钾对斑马鱼的毒性作用。结果表明,24h、48h、72h、96h的LC50分别为426.5795mg/L、141.2538mg/L、138.0384mg/L、128.8250mg/L,经鱼类急性毒性分级表判断重铬酸钾为低等毒。同时研究了不同浓度Cr6+对斑马鱼组织过氧化氢酶(CAT)活性的影响,发现鱼肝和肌肉中的CAT活性随着浓度的增加呈抛物线。     

镉对转基因斑马鱼的急性毒性效应

采用转基因斑马鱼T_g(lyz:EGFP)-Lyz fish为模型,探讨了重金属镉对转基因斑马鱼的胚胎毒性和免疫毒性.结果表明,相比空白对照组,0.1μM和1μM CdCl_2对斑马鱼胚胎产生一定的毒性影响,并促进溶菌酶(lysozyme C,lyz)标记的斑马鱼体内的中性粒细胞的荧光表达.随着CdCl_2浓度的增加,24 h血流障碍、56 h死亡数和56 h孵化抑制等指标均呈现递增趋势;在CdCl_2诱导下的斑马鱼仔鱼体内的中性粒细胞增多并向发生炎症部位分布,主要趋向于肝脏部位聚集.因此,本研究对转基因斑马鱼在环境污染物的免疫毒性检测方面有着重要意义.     

复合微生态制剂在黄羽乌骨仔鸡中的应用研究

为研究益生菌、中草药和蝇蛆粉作为饲料添加剂对黄羽乌骨仔鸡生长性能、免疫功能、抗氧化水平和盲肠内容物pH及定植益生菌数的影响,选取300只健康1日龄仔鸡,随机分为益生菌剂1组、益生菌剂2组、益生菌剂2+中草药+蝇蛆粉组、中草药+蝇蛆粉组和空白组。结果表明:1微生态制剂对平均日采食量无显著影响(P0.05),但能显著增加平均日增质量和降低料质量比(P0.05)。2微生态制剂能显著刺激胸腺、法氏囊和脾脏等免疫器官的生长并且使免疫球蛋白IgG的含量和溶菌酶的活性分别提高了46%和69%。3微生态制剂能通过提高血液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性来显著增强机体抗氧化水平并且肝脏中以上3种酶活性的提高程度更大。4微生态制剂可显著降低肠道p H值并且使肠道益生菌的比例增加20.2%。     

氯霉素对斑马鱼幼鱼发育及免疫毒性的研究

以野生型及转基因Tg(lyz:EGFP)斑马鱼幼鱼为研究对象,研究氯霉素对斑马鱼幼鱼的发育毒性及对免疫细胞的影响。用不同浓度的氯霉素分别处理72 h,观察斑马鱼幼鱼的生存率、畸形率和形态变化,以及标记绿色荧光免疫细胞在斑马鱼幼鱼中的数量。结果显示,随着氯霉素浓度(≥100 mg/L)的升高和暴露时间的延长,斑马鱼的存活率和孵化率降低,死亡率升高;氯霉素对斑马鱼幼鱼的致畸作用,主要表现为心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲;通过对Tg(lyz:EGFP)品系的观察,发现氯霉素(≥75 mg/L)可以降低斑马鱼幼鱼免疫细胞的数量。研究表明,氯霉素对斑马鱼幼鱼的致畸和致死作用具有剂量、时间依赖性,并可以导致斑马鱼幼鱼的免疫细胞数量减少,具有免疫毒性。     

27种中药提取物抑制血管生成活性的评价

对27种中药分别采用石油醚、乙酸乙酯、水进行系统提取,利用转基因斑马鱼对提取物进行血管生成抑制活性检测。提取物处理斑马鱼胚胎24 h后,统计斑马鱼节间血管(ISV)的生长情况,并计算抑制率;部分有活性的提取物进一步采用鸡胚尿囊膜（CAM）实验进行验证。实验结果显示,川芎水提物、白芍乙酸乙酯提取物、竹黄水提物、鬼箭羽乙酸乙酯提取物和水提物、乳香水提取物、大青叶乙酸乙酯提取物显示出抑制血管活性现象;其中川芎水提取物、鬼箭羽乙酸乙酯和水提物、乳香水提取物对鸡胚尿囊膜血管生成具有明显的抑制作用。从27种中药中发现了7种提取物具有抑制转基因斑马鱼节间血管生长的作用,这种作用与血管内建生长因子受体2(VEGFR2)表达有关。     

以秀丽隐杆线虫为模型的玛咖功效评价

先对玛咖进行脱油、水提、冻干,再将所得水提物冻干品与Escherichia coli OP50菌液进行混合,稀释至终质量浓度为1,2mg/mL.以秀丽隐杆线虫(简称线虫)为模型,考察玛咖水提物对线虫的抗氧化作用:经寿命、产卵、吞咽、运动能力实验表明,玛咖水提物对线虫无明显毒性作用,且1,2mg/mL玛咖水提物均能显著延长线虫寿命;由玛咖水提物对线虫热激氧化压力诱导表明,玛咖水提物对线虫体外热激氧化压力有保护作用;通过油红O对脂肪染色表明,玛咖水提物具有一定降脂功效.     

Keap1-Nrf2-ARE通路及其参与肝脏疾病病理机制研究进展

核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是细胞抗氧化应激(oxidative stress,OS)反应中的中枢调节者,其与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1)及抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)共同构成Keap1-Nrf2-ARE通路,诱导编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达,在细胞抗OS的主要防御机制中发挥关键作用,与肝脏疾病的发生发展联系密切。本文对Keap1-Nrf2-ARE通路作用机制、激动剂和参与肝脏疾病病理机制的最新研究进展综述如下。     

NF-κB信号通路调控绵羊肺炎支原体感染宿主肺泡上皮细胞的作用机理

分析转录因子细胞核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路在绵羊肺炎支原体感染肺泡上皮细胞中的分子机制.用不同浓度的抑制剂BAY11-7082与细胞孵育,用Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide(MTT)法检测细胞活性,以及用实时定量PCR检测NF-κBp65和白细胞介素-8(IL-8)mRNA的表达水平,用试剂盒检测caspase-3的活性和H2O2浓度变化,接着用细菌计数检测支原体对细胞的致病力变化.结果显示,当NF-κB抑制剂BAY11-7082浓度为1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L不影响细胞活性;在24h,绵羊肺炎支原体可以显著提高NF-κBp65和IL-8 mRNA的表达水平,显著增加caspase-3的活性和H2O2分泌水平,而BAY11-7082能够显著降低IL-8mRNA的表达和caspase-3活性、胞内肺炎支原体数量;结果表明NF-κB信号通路在绵羊肺炎支原体致病机制中发挥重要作用.     

当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-κB、TNF-α表达的影响

探讨当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和核转录因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响及其可能作用机制.小鼠连续腹腔注射4.0g·L-1麻黄素溶液,同时用当归多糖溶液(12.5,25.0g·L-1)进行灌胃,分别在5,10,15d时用分光光度法检测各组小鼠肝组织T-AOC、GSH-PX活性的变化,免疫组化法检测小鼠肝组织中NF-κB和TNF-α表达的变化.结果显示实验对照组小鼠肝组织T-AOC、GSH-PX活性明显降低(P0.01),肝组织NF-κB和TNF-α表达量显著增强(P0.05或P0.01),而当归多糖组T-AOC、GSH-PX活性与实验对照组相比显著升高,NF-κB和TNF-α表达量明显降低(P0.05或P0.01).结果表明,麻黄素影响小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-κB、TNF-α的表达,当归多糖能够提高小鼠肝组织抗氧化酶活性,抑制NF-κB和TNF-α的表达,对麻黄素致小鼠肝损伤有一定的保护作用.     

微注射人TCP10L基因对斑马鱼形态的影响

利用模式生物斑马鱼,通过微注射的方法,研究了人肝脏特异性转录因子TCP10L对斑马鱼早期胚胎发育的影响.结果显示:人TCP10L基因对斑马鱼胚胎发育有一定的毒性.表现为早期的脊索发育异常,个体严重畸形;当血液循环出现后,表现为血流延缓和围心腔水肿等症状.该项研究表明:人肝脏特异性转录因子TCP10L在斑马鱼胚胎中的过表达会引起显著的形态异常和心血管障碍,并且这种影响与其是否在斑马鱼肝内的特异表达有关,为进一步探明该转录因子在人肝脏内发挥的功能奠定了基础.     

藏药波棱瓜子总木脂素对刀豆球蛋白(ConA)致免疫性肝损伤小鼠保护作用及其机制探讨

目的:波棱瓜子是常见的用于治疗肝病的藏药,疗效确切.前期研究表明,总木脂素是波棱瓜子抗肝损伤的有效部位,但疗效尚不明确.本研究拟考察藏药波棱瓜子总木脂素对ConA致小鼠免疫性肝损伤的保护作用,并进一步探讨其对抗肝损伤的作用机制.方法:采用尾静脉注射一次性ConA(20mg/kg)诱发小鼠免疫性肝损伤,造模8h后取血样和肝脏,考察不同剂量的波棱瓜子总木脂素对各组小鼠脏器系数、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、骨过氧化物酶(MPO)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等生化指标活力或水平的影响;以HE染色对肝组织进行组织病理学检查;免疫组织化学法检测波棱瓜子总木脂素对各组小鼠肝脏中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、核转录因子-κB(NF-κB)表达的影响.结果:波棱瓜子总木脂素可以降低ConA所致免疫性肝损伤小鼠肝脏系数及血清ALT、AST、ALP活力,显示出较好的保肝作用.同时波棱瓜子总木脂素也可降低肝损伤小鼠血清NO水平和MPO、NOS活力,并减少肝组织匀浆中MDA的含量,增强SOD和GSH-Px活性,表现出良好的抗氧化作用;免疫组化结果显示,波棱瓜子总木脂素还能抑制诸如TNF-α、IFN-γ、IL-4、NF-κB等促炎症因子的表达,促进抗炎症因子IL-10的表达,从而抑制肝脏炎症反应而发挥其保肝作用.病理观察结果也表明,波棱瓜子总木脂素能减轻ConA对肝组织的损伤.结论:波棱瓜子总木脂素对ConA致小鼠免疫性肝损伤都具有一定的保护作用,其保肝作用可能与其抗炎、抗氧化能力有关.     

高内涵筛选NF-κB信号通路的技术体系建立

NF-κB是参与免疫调节、炎症反应、肿瘤发生等过程重要的转录因子,在TNFα、IL-1β、LPS等因子诱导下NF-κB发生核转位并激活其转录活性。尝试利用高内涵筛选(High Content Screening,HCS)和RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术建立NF-κB核转位高通量筛选体系,该体系的应用将有助于发现新的NF-κB信号通路调节因子,为免疫与肿瘤的机制研究提供线索。