大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因克隆与表达研究

根据同源性设计引物，通过RT－PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因，并由此推测出其相应的氨基酸序列。将该基因克隆到表达载体pPIC9K中，经电激转化后整合至毕氏酵母细胞中获得表达。该表达产物经两步柱层析后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得单一条带，并表现较强的生色底物活性。     

尖吻蝮蛇毒不同蛋白酶水解物的制备及抗氧化活性研究

【目的】研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒的不同蛋白酶水解产物的制备及抗氧化活性。【方法】分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解尖吻蝮蛇毒,以水解物的水解度、清除自由基活性、金属离子螯合能力和总还原力作为抗氧化活性比较指标来选出最佳水解蛋白酶,并比较该蛋白酶水解物在超滤后得到的不同分子量组分的抗氧化活性大小。【结果】碱性蛋白酶水解物的清除DPPH自由基活性、亚铁离子螯合能力和总还原力均为最佳;该酶解物经超滤得到的3个组分中,分子量为3～10kDa的组分对DPPH自由基和羟基自由基清除能力最强,分子量大于10kDa的组分的亚铁离子螯合能力和总还原力最强。【结论】尖吻蝮蛇毒的不同蛋白酶水解物均具有抗氧化活性,其中用碱性蛋白酶水解物抗氧化活性较强。     

皖南尖吻蝮蛇毒出血毒素Ⅰ氨基酸序列初步研究

中国皖南尖吻蝮蛇（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎａｃｕｔｕｓ）毒出血毒素Ｉ（ＡａＨＩ）氨基酸序列得到初步测定．ＡａＨＩ的Ｎ端１３个残基序列为ＳＴＥＦＱＲＹＭＥＩＶＩＶ．序列比较表明ＡａＨＩ与其它种属来源的低分子量（２０～２４ｋＤ）蛇毒出血毒素和金属蛋白酶有较高的同源性．     

石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒活性抑制作用的初步研究

【目的】寻找用于治疗尖吻蝮(Agkistrodon acutus)咬伤的中草药石柑子(Pothos chinensis)的药效实验证据。【方法】将制备所得石柑子水提物与尖吻蝮蛇毒混合孵育40min,检测混合液中蛇毒的磷脂酶 A2 活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性。【结果】石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒的磷脂酶 A2 活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性都有明显抑制作用。【结论】研究结果初步证实了石柑子对尖吻蝮咬伤具有治疗效果。
     

尖吻蝮蛇蛇毒酸性磷脂酶A2三维结构的计算机模拟研究

利用同源模建方法,借助于分子力学优化和分子动力学模拟,构建了尖吻蝮蛇蛇毒酸性磷脂酶Ａ２Ｉ和Ａ２Ⅱ的三维结构,用Ｐｒｏｆｉｌｅ－３Ｄ和Ｐｒｏｓｔａｔ检测模建蛋白的结构以确证其合理性,并把模建蛋白与知同源蛋白的空间结构进行了比较,对模建蛋白的结构与的关系进行了讨论,认为在钙离子 度相同的情况下,钙离子的结合可能使酸性磷脂酶Ａ．ａＡＰＬＡ２Ⅱ中ＴｒＰ的荧光强度比Ａ．ａＰＬＡ２Ⅰ中Ｔｒｐ的荧光强度变化大。     

尖吻蝮蛇毒对人卵巢癌A278O细胞的抑制作用研究

【目的】研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒对人卵巢癌A2780细胞(后简称A2780细胞)形态学特征、细胞增殖活力及粘附能力的影响。【方法】采用倒置荧光显微镜观察在不同质量浓度和时间条件下,尖吻蝮蛇毒对A2780细胞形态学特征的影响;采用CCK-8法检测细胞增殖率的变化,使用细胞计数法检测尖吻蝮蛇毒对细胞粘附能力的影响。【结果】当尖吻蝮蛇毒质量浓度为3.125μg·mL-1时,A2780细胞出现少量皱缩、变圆、凋亡的现象;随着尖吻蝮蛇毒质量浓度增加,细胞凋亡的现象愈加明显。当用50μg·mL-1的尖吻蝮蛇毒处理A2780细胞1h后,被处理细胞出现少量皱缩、变圆现象;12h后,被处理细胞粘连成团,出现大量凋亡现象。在3.125～200μg·mL-1范围内,随着尖吻蝮蛇毒质量浓度的增加,A2780细胞增殖活力逐渐减弱,且呈明显剂量依赖关系。当用3.125μg·mL-1的尖吻蝮蛇毒处理A2780细胞时,细胞粘附率降为78.26%;当蛇毒质量浓度为25μg·mL-1时,细胞粘附率降为不足10%。【结论】尖吻蝮蛇毒可明显影响A2780细胞的形态学特征,抑制该细胞的增殖活力以及粘附能力。     

黑老虎醇提物对尖吻蝮蛇毒主要酶类的抑制作用

【目的】探究中草药黑老虎(Kadsura coccinea)醇提物对尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒中主要酶类的抑制作用。【方法】用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡黑老虎后再进行超声波处理得到醇提物;通过体外酶活抑制实验分别检测醇提物对尖吻蝮蛇毒中磷脂酶A2、蛋白水解酶、透明质酸酶、类凝血酶的抑制作用。【结果】黑老虎醇提物对尖吻蝮蛇毒中的蛋白水解酶、磷脂酶A2和透明质酸酶具有明显的抑制作用。当蛇毒与醇提物的质量比分别为1∶100,1∶10和 1∶5时,后者能抑制蛇毒中98%磷脂酶A2活性、79%蛋白水解酶活性和65.14%透明质酸酶活性。同时,醇提物能够明显抑制尖吻蝮蛇毒水解纤维蛋白原和类凝血酶的活性。【结论】研究结果证实了黑老虎醇提物能有效抑制尖吻蝮蛇毒中的主要酶类,为深入研究黑老虎药材的抗蛇毒机制提供了理论依据。     

蛇莓乙醇提取物抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性初探

【目的】初步探究蛇莓(Duchesnea indica)对尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒蛋白水解酶的抑制作用。【方法】采用不同极性有机溶剂对蛇莓乙醇提取物进行分级萃取,结合硅胶薄层层析(TLC)进行分离,再利用气相色谱-质谱法(GCMS)对抑制蛋白水解酶作用最强的活性部位进行组分分析。【结果】乙酸乙酯萃取相具有较强的抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性;经硅胶TLC分离从中获得条带1、条带2、条带3和条带4共4个条带,且条带4的尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶抑制活性最强。通过GC-MS分析检测出条带4中存在15种成分,其中2,4-二叔丁基苯酚、正十六烷酸、十八烷酸、十六烷酸,2-羟基-1-(羟甲基)乙酯、硬脂酸-2-羟基-1-(羟甲基)乙酯和10,13-十八碳二炔酸甲酯可能与抑制蛇毒活性相关。【结论】蛇莓中存在抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶的功效组分,可以作为蛇伤药物开发的资源。     

类凝血酶Agacutin的质量标准的研究

为研究止血活性的Agacutin的质量标准，通过鉴别试验、人血浆和牛纤原凝结活性、HPLC、SDS—PAGE、鲎试剂和其它体内试验等方法，研究了Agacutin的酶活性，纯度，分子量，内毒素，异常毒性，过敏试验和出血毒性等质量标准指标。结果显示，HPLC法纯度平均为98％，SDS—PAGE电泳显示了异二聚体和31733±1157Da的全分子量。1单位酶的人血浆和牛纤原凝结时间为60±20s和188±20s．0．25KU的异常毒性和过敏剂量、0．2KU／0．2ml出血毒测试、低于10EU／KU内毒素的热源测试、磷脂酶A、L一氨基酸氧化酶和磷酸酶活性等显示了阴性反应。根据实验结果，初步确定了Agacutin的质量指标：正相HPLC纯度I〉95％，SDS—PAGE为异二聚体和全分子量31±2kDa，1单位酶的人血浆和牛纤原凝结时间为60±20s和188±20s，内毒素〈10EU／KU，异常毒性和致敏剂量为0．25单位，出血毒剂量0．2单位／0．2m1．     

长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶制品的生化分析

对长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的理化及酶学性质进行系统研究． 结果表明， 该酶为一分子量为３８ ０００， 等电点为４５０ 并对温度有很高稳定性的糖蛋白， 该酶的最适ｐ Ｈ 值为８０，其活力可被 Ｄ Ｆ Ｐ 和 Ｐ Ｍ Ｓ Ｆ抑制．     

蕲蛇蛇毒中凝血酶样酶的分离纯化与特性

蕲蛇粗毒经DEAE -SephadexA - 5 0、POROS 5 0HS及TSKG30 0 0SW分离纯化 ,得到 1个具有凝血酶活力的峰 .该峰经SDS -PAGE和PAGE检测均为一条带 ,分子量约 2 8.0kDa ,加DTT处理后 ,拆分为约 14.8kDa的亚基 .其凝血酶活力为 14.7NIHu/mg ,精氨酸酯酶活力为 2 1.98TAMEμmol/mg·min .该组分具有激活因子ⅩⅢ的活性 ,但没有明显的出血反应 .肝素不影响该组分的凝血酶和精氨酸酯酶活性 ,EDTA、PMSF、DFP则会产生不可逆抑制作用 ,表明该组分属于金属蛋白 .     

硫酸铵盐析在蕲蛇毒凝血酶样酶分离中的应用

探讨了硫酸铵沉降对蕲蛇毒中凝血酶样酶的初步分离效果的影响 ,确定出最佳处理条件 :2 .0 %的蕲蛇毒在pH 5 .0及 4 5 %饱和度的硫酸铵溶液中盐析沉降蕲蛇毒中非凝血酶样酶杂蛋白 ,上清液即为所分离的凝血酶样酶组分     

大肠杆菌二硫键异构酶DsbA和脯氨酸异构酶PPIaseA双顺反子表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌二硫键异构酶ＤｓｂＡ的编码基因ｄｓｂＡ和大肠杆菌脯氨酸异构酶ＰＰＩａｓｅＡ的编码基因ｒｏｔ,并将ＤｓｂＡ和ｒｏｔ以双顺反子形式克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ｐＫＫ２３３－２中。在ＩＰＴＧ的诱导下,ＤｓｂＡ和ＰＰＩａｓｅＡ获得了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：ＤｓｂＡ、ＰＰＩａｓｅＡ的表达水平分别为占菌体裂解上清液总蛋白质的４．３２％和４．０６％。     

铜绿假单胞菌的LexA蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的阻遏蛋白LexA进行基因克隆、重组表达及蛋白纯化.方法:采用PCR法从PAO1株基因组中扩增出1 086 bp的LexA基因,将此基因片段插入到表达载体pET32a( )上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.包涵体洗涤后用8 mol/L尿素溶解,以镍离子亲合柱层析作为第1步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第2步精细纯化,反相高相液相色谱法(HPLC)测定蛋白的浓度.结果:LexA以包涵体形式表达,表达量为45%,经镍离子亲合柱层析纯化后LexA蛋白纯度达到85%以上,回收率大于80%,镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析两步纯化目的蛋白,经HPLC测定,最终目的蛋白的纯度为98.97%.结论:在pET32a( )表达系统中实现了PA的LexA蛋白的高效表达,两步纯化法获得高纯度的目的蛋白,为进一步鉴定LexA靶位点奠定了基础.     

基于关键酶表达的发酵调控与分子改造策略对E.coli产丁二酸的影响

考察E.coli JM001及其重组菌株E.coli JM002生物发酵生产丁二酸的性能。E.coli JM001在两阶段发酵产丁二酸过程中通过在有氧培养阶段添加乙酸钠,即可提高丁二酸的生产能力,厌氧阶段的丁二酸收率可达84%,但会有较多的副产物乙酸和丙酮酸积累。以E.coli JM001为出发菌株,敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)并导入来源于枯草芽孢杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)基因,构建了重组菌株E.coli JM002,该重组菌株在两阶段发酵的有氧培养过程中不需添加乙酸钠,转厌氧后菌株也具有转化葡萄糖合成丁二酸的能力,丁二酸收率可达86%,副产物积累很少。     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

Cloning and molecular characterization of a gene encoding MAP kinase from maize and its expression in E. coli

A new MAPK gene, ZmSIMK1 （Zea mays L. salt-induced mitogen-activated protein kinase 1）, is isolatod from a maize eDNA library. The full-length ZmSIMK1 gene contains 1636 bp and an open reading frame of 1122 nucleotides capable of eneoding 373 amino acid polypeptides with a predicted molecular mass of 42.3 kda and pI of 6.01. The putative ZmSIMK1 protein contains all 11 conserved subdomains that are characteristics of serine/threonine protein kinases and the TEY motif, which is the putative phosphorylation site. Northern blot analysis shows that ZmSIMK1 is ubiquitously expressed in roots, stems, and leaves of maize seedlings and its mRNA accumulation is observed in maize seedlings treated with 30 mmol/L PEG-6000 and 137 mmol/L NaCl, but the expression of ZmSIMK1 is not significantly affected by 4℃ treatment. The expression vector pET-ZmSIMK1 is constructed by inserting the coding region of ZmSIMK1 eDNA into pET-42a（＋）, and transformed into E. coli strain BL21（DE3）. A 77kda fusion protein is induced by the further culture at 37℃ after addition of 1 mmol/L IPTG.     

蕲蛇毒中抑制ACE活性组分的分离纯化与表征

蕲蛇粗毒流经强阴离子交换色谱POROS 2 0HQ柱 ,经毛细管电泳仪检测 ,5个蛋白峰具有ACE抑制活性 ,对最强的活性峰进行PAGE切割电泳的分离 ,得到 3条带 ,经检测只有第三条带 (AI - 3)具有ACE抑制活性 .该组分的分子量为 2 0 2 0 0 (非还原 ) ,加DTT处理后 ,分子量为 2 590 0 .其IC50 为 0 .10mmol/L .