两种植物病毒编码蛋白的基因沉默抑制子功能鉴定

采用农杆菌浸润方法以及重组的马铃薯X病毒(PVX)表达载体, 研究了甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)编码的P14蛋白和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)编码的S6蛋白对植物基因沉默的抑制作用. 绿色荧光蛋白(GFP)表型观察及核酸杂交结果表明, 这2种病毒基因均能够强烈抑制转基因本生烟(16C)中由同源序列引起的gfp基因沉默, gfp基因mRNA的含量明显高于未发生沉默抑制的对照植株, 并导致PVX感染后的寄主症状加重, 说明它们可能是由病毒编码的RNA沉默抑制因子. 其中, RBSDV S6基因对植株体内基因组DNA甲基化过程的抑制作用更为强烈.     

中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ A-Rich区的功能鉴定

DNAβ是近年来在一些单组分双生病毒中发现的一类新型卫星DNA分子, DNAβ对于这些病毒诱导典型的病害症状是必需的. DNAβ上含有3个相对保守的区域: 共同区、βC1基因和A-Rich区(A含量 > 60%). 在对中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)DNAβ βC1基因的功能突变研究的基础上, 对TYLCCNV-Y10 DNAβ上的A-Rich区进行了功能鉴定. 对TYLCCNV-Y10 DNAβ A-Rich区进行缺失突变后发现, A-Rich缺失突变体依然能够在植物中稳定复制和系统移动, 因此A-Rich区对于DNAβ的复制并不是必需的. 免疫捕获PCR检测发现, A-Rich缺失突变体能够包裹在TYLCCNV-Y10 DNA-A编码的外壳蛋白之中, 表明它并不能决定DNAβ的包裹, 但是A-Rich区的缺失使病毒症状减弱.     

甜菜坏死黄脉病毒RNA5对病毒致病性的影响

利用甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV) RNA5全长侵染性cDNA克隆体外转录获得的RNA5体外转录物, 与只含有RNA1, 2以及RNA1, 2和3的两个BNYVV突变株BNYVV-Hu0和BNYVV-Hu3的RNAs分别混合, 并接种于寄主植物番杏(Tetragonia expansa)和甜菜(Beta vulgaris L). 结果表明, RNA5是BNYVV中除RNA3以外的另一个病毒致病性相关分子, 它的存在能够提高病毒的侵染效率和在寄主体内的积累水平, 并与RNA3协同作用, 导致病毒侵染后的症状表现加重.     

卫星DNA沉默载体的改良及其改变矮牵牛叶色和花色的研究

利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)机制可以从基因组序列入手来进行植物基因功能研究, 这是一种反向遗传学方法. 本室曾成功利用中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)的卫星DNA构建了基因沉默的载体. 本研究对该载体进行了改良, 在本氏烟上对Su基因的沉默测试表明, 改良后的载体与原载体诱导沉默的效率没有差别, 但是改良后的载体构建沉默克隆的过程得以简化. 进一步用改良后的沉默载体分别抑制矮牵牛内源基因Su和CHS基因的表达. 含Su基因的沉默载体接种矮牵牛大约2周后, 矮牵牛沿叶脉开始黄化; 含CHS基因的沉默载体接种矮牵牛约1个月后, 新开的牵牛花上出现花色的褪变, 并由单色花变成了杂色花.     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草. Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm)基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高. 以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

基因转录后沉默信号可以在拟南芥嫁接体内快速双向传递

RNA干扰(RNAi)是引起生物体基因转录后沉默的新技术之一, 通过转基因向植物体内引入特异的RNA沉默信号, 已成功用于基因功能研究. 我们利用拟南芥动蛋白异型体KatB和KatC两个基因上共有的一段同源编码序列(168 bp)构建了能导致目标基因KatB和KatC双基因转录后沉默的DEX (dexamethazone) 诱导性RNAi载体. RT-PCR和Northern blot结果显示, 转基因拟南芥纯合体植株(简称RNAi型植株)经DEX诱导后,KatB和KatC的mRNA逐渐减少, 表明这两个基因发生了转录后沉默作用. 用改进后的简易方法将RNAi型与野生型拟南芥植株进行高效率嫁接, 对砧木和接穗中目标基因mRNA变化进行了半定量RT-PCR检测. 结果表明, 无论用RNAi型植株作为砧木或接穗, DEX诱导产生的基因沉默信号均能导致相应野生型接穗或砧木中KatB和KatC mRNA的减少, 证明说明基因转录后沉默信号可以通过嫁接面在拟南芥体内双向传递; 与已报道的基因沉默信号在烟草嫁接体内传递速度相比, 拟南芥基因沉默信号的传递更为迅速．     

病毒颗粒中氢氘置换的证实

已知重水(D₂O)能增加某些病毒的热稳定性, 但其机理不清. 用基质辅助气体同位素质谱法, 研究了日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)和甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)用D₂O处理后, 测定病毒及其RNA结构中的氘氢比值(D/H), 以δD_SMOW表示. 结果说明, 与正常病毒相比, 上述D₂O处理后的病毒样品中δD_SMOW值明显升高, 其升高值与病毒样品的加入量呈良好的线性关系. 实验还指出, D₂O处理后的病毒δD_SMOW值的升高与其热稳定性的升高是相关联的. 实验结果证明, D₂O处理导致病毒及其RNA结构中发生氢氘置换, 氢氘置换可导致病毒生物学性状(热稳定性增加)的表型改变.     

利用病毒诱导的基因沉默技术研究一个豌豆PI同源基因的功能

在植物发育生物学研究中, 对很多非模式植物基因功能的研究总是因为缺乏快速有效的方法而受到限制. 病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究基因功能的方法. 本研究利用一种基于PEBV (pea early browning virus)的VIGS体系研究了豌豆PsPI基因的功能. 豌豆在其PsPI基因沉默后出现了类似于拟南芥pi突变体/金鱼草glo突变体的表型, 导致花瓣向萼片以及雄蕊向心皮转变. 半定量RT-PCR分析发现, 在VIGS-PsPI沉默植株花苞中, PsPI基因的mRNA水平显著下降. mRNA原位杂交结果显示, PsPI基因早期在起始共同原基的部位表达, 后期在花器官第二、三轮表达. 本研究结果证明了PsPI基因具有拟南芥PI/金鱼草GLO同源基因的功能, 说明这类基因在进化和功能上是相当保守的, 同时也表明VIGS是一种研究植物基因功能的快速有效的方法, 特别是对于那些转化困难的非模式植物基因功能的研究具有更为重要的意义.     

水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)是中国及东南亚国家水稻上的一个重要病原, 但有关RGDV与植物细胞互作的分子机制仍不清楚. 本研究利用农杆菌共渗透的方法鉴定了RGDV基因组S11片段编码蛋白Pns11在转GFP (green fluorescent protein)基因本生烟纯合系(Nicotiana benthamiana line 16c)中的抑制子活性. 在该系统中, Pns11 能抑制由GFP正义RNA介导的局部和系统沉默, 并能灭活RNA沉默信号或阻断沉默信号的移动. 体外表达Pns11能增强马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)在本生烟上的致病性. 该抑制子在局部和系统沉默抑制实验中能降低siRNA 的累积, 但不能完全消除其存在. 结果表明, Pns11干扰了RNA沉默途径的起始阶段.     

表达Cryptogein基因的烟草抗病性和耐盐性增强

隐地蛋白(cryptogein, Crypt)是由隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)分泌的一种分子量约为10 kD的蛋白类激发子. 用农杆菌介导的叶盘转化法获转Crypt (PAL::Crypt)和CryK13V (CaMV35S::CryK13V)基因的烟草植株. 接种试验结果表明, T₂代转基因烟草株系对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var nicotiana, Ppn)、赤星病菌(Alternaria alternata)和野火病菌(Pseudomonas syringae pv tabaci)的抗性显著增强. Northern杂交和RT-PCR分析结果表明, 低水平的表达转化基因Crypt和CryK13V就足以激活PR-1a和PR-5等防卫反应相关基因的表达; 在PAL::Crypt转化系统中, 病原菌Ppn能快速和高水平诱导PR-1a等病程相关基因的表达, 表明诱导型PAL启动子对入侵病原菌能及时识别并快速、有效地激活防卫反应, 从而赋予转基因植株抵抗病原菌侵染的能力. 研究还发现, 表达Crypt和CryK13V基因的烟草植株耐盐性比对照明显提高, 转化株系中高水平组成型表达PR基因和转录因子可能与耐盐性增强有一定正相关性. 上述结果表明, 植物对生物和非生物逆境的抗性途径和机制存在着交叉.     

病毒诱导的烟草DHS基因的沉默

将本生烟草(Nicotiana benthamiana) DHS (deoxyhypusine synthase, 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶)基因的cDNA片段插入到马铃薯X组病毒(PVX)载体中, 构建重组病毒载体PVX-NbDHS. 通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统, 抑制本生烟草DHS基因表达. 感染植株表现为生长增强、叶片叶绿素含量下降、叶片衰老延缓和开花推迟. 半定量RT-PCR和Northern blot结果表明, PVX-NbDHS-VIGS植株中DHS mRNA丰度显著下降. Western blot检测表明, DHS靶蛋白eIF-5A的表达量与DHS呈平行下调变化. 综合分析植物表型和相应基因表达水平, 可以推断DHS在植物生长与发育中起重要作用.     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

重组逆病毒介导的Immunocaspase-3分泌性T细胞对ErbB2阳性乳腺癌的杀伤作用

将Immunocaspase-3基因转染Jurkat T淋巴细胞, 使其稳定地分泌性表达靶向促凋亡蛋白Immunocaspase-3, 间接免疫荧光检测表明该蛋白可内化进入ErbB2阳性的SKBr3乳腺癌细胞, 细胞计数结果表明乳腺癌细胞的生长和增殖受到明显抑制. 进一步将Immunocaspase-3基因克隆入逆转录病毒载体pLNCX, 转染PA317细胞进行包装, 挑选高滴度的包装细胞株收获病毒. 用收获的病毒感染刺激分裂的人外周血T淋巴细胞, 经筛选后通过尾静脉注射给荷有SKBr3乳腺癌的裸鼠, 观察到肿瘤生长明显受到抑制(抑制率 73.25%), 裸鼠存活时间较对照组延长80.95%. 免疫组织化学染色结果表明裸鼠肿瘤组织中有Immunocaspase-3蛋白分布, TUNEL检测证实肿瘤细胞发生凋亡. 上述结果表明, T淋巴细胞分泌的Immunocaspase-3在裸鼠体内可以识别和进入ErbB2阳性的乳腺癌细胞, 抑制肿瘤生长.     

类黄酮物质apigenin和daidzein诱导AM真菌侵染十字花科植物­芥菜

豆科植物根分泌物中的类黄酮物质可能是根瘤菌“nod”结瘤基因和丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM)真菌共生基因表达的信号分子. 芥菜(十字花科植物)是一种非菌根植物, 自然情况下, 根分泌物中缺乏类黄酮等信号物质, 不能与AM真菌形成共生关系. 当用适量的类黄酮(apigenin或daidzein)处理AM真菌时, Trypan blue染色结果显示, 2种AM真菌(G. intraradices和G. mosseae)成功地侵染了非菌根植物芥菜的根. AM真菌在非菌根植物芥菜根中生长、定殖, 并产生了幼嫩的孢子, 从而完成了生活史. AM菌根真菌是所有真菌中惟一具有ALP酶活性的真菌, ALP活性染色结果也证实了AM真菌侵染了芥菜的根. 运用nested PCR和特异性的分子探针, 探测了G. intraradices和G. mosseae在非菌根植物芥菜根中的存在. 上述证据能够充分证明, 类黄酮物质诱导G. intraradices和G. mosseae侵染非菌根植物并建立了共生关系.     

农杆菌介导法获得转pac1基因小麦并表现对大麦黄矮病毒的抗性

自裂殖酵母中克隆得到pac1基因, 与GenBank中相关的核苷酸序列有99.3%的相似性. 编码蛋白质序列分析表明, 其具有RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域. 体外活性测定表明, 以pET-5a系统在大肠杆菌中表达的pac1产物能够降解dsRNA. 将pac1导入双元载体pBI121, 以培养7~10 d的小麦幼胚为受体材料, 利用农杆菌株LBA4404对小麦品种陇鉴127进行转化, 获得了41株G418抗性植株, 经点杂交(dot blot)、RT-PCR和nptⅡELISA检测证实, 其中25株整合有外源基因并能正常表达. 对这25株转基因小麦进行大麦黄矮病毒的抗性鉴定表明, 有12株表现低度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时发病且严重; 有12株表现中度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时局部有不严重症状; 有1株表现高度抗性, 两种情况下均无症状. 抗性实验结果表明了pac1介导的抗性具有剂量效应的特点.     

杆状病毒P49蛋白的Caspase切割位点的鉴定

海灰翅夜蛾核型多角体病毒(SlNPV)的p49基因, 可抑制病毒感染引起的昆虫细胞Sf 9的凋亡. 用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达的P49蛋白可抑制Caspase的活性. 通过氨基酸序列测定发现, P49蛋白的91 ~ 95位的氨基酸序列是⁹¹TVTDG⁹⁵. P49蛋白在体外可被人及家蚕Caspase切割, 切割后均产生约10和40 kD的2个片段. 经定点诱变得到的P49蛋白94位氨基酸突变体不能被人及家蚕Caspase切割, 同时也失去对Caspase的抑制功能. 而91位突变体蛋白仍可被Caspase切割, 并保留了对Caspase 抑制的部分活性. P49蛋白不仅作用于下游的效应Caspase, 也可作用于上游的启始Caspase, 它是一个广谱的Caspase抑制剂.     

小麦-长穗偃麦草抗白粉病异代换系中一个新的磷酸丝氨酸氨基转移酶基因的克隆

以抗白粉病的小麦-长穗偃麦草异代换系山农551为材料, 在接种小麦白粉病菌48 h制备样品电子显微镜观察, 结果表明山农551在白粉病菌侵染早期抑制孢子萌发和菌丝生长. 在接种病菌48 h后提取RNA, 利用cDNA RDA和RACE技术克隆WRP1和RPW2共2个基因. BLAST分析表明该二基因均是尚未被克隆的新基因. WRP1没有大的ORF; RPW2的翻译产物含有保守的氨基转移酶结构域, 与多种生物的磷酸丝氨酸氨基转移酶有同源序列, 可以认为是一新的磷酸丝氨酸氨基转移酶基因. Northern杂交结果显示在小麦白粉病侵染早期RPW2在山农551的叶片中就开始表达. RPW2探针同山农551及其亲本鲁麦5号、济南13和长穗偃麦草基因组DNA进行Southern杂交结果显示, 探针与鲁麦5号和济南13无杂交信号, 而与山农551和长穗偃麦草都有较强的杂交信号, 这表明RPW2来源于长穗偃麦草基因组.     

利用人工控制细胞死亡策略培育抗稻瘟病水稻

利用细菌编码RNase的barnase 基因及其特异抑制剂编码基因barstar构成的双元组分系统, 把本实验室构建的具有稻瘟菌(Magnaporthe grisea)诱导活性的嵌合启动子与barnase基因融合, 再与由CaMV 35S启动子驱动的barstar的构件融合, 构建植物表达载体pWBNBS和pPBNBS, 转化水稻, 并对转基因水稻进行了抗稻瘟病和白叶枯病的检测. 结果表明, 接种稻瘟菌后, 转基因水稻植株中barnase基因受诱导表达; 在稻瘟菌侵染诱导下, barnase的表达超过barstar的抑制, 导致转基因水稻叶片出现类似过敏感应, 表现出对稻瘟病的抗性; 转基因水稻对白叶枯病表现出一定的抗性. 这些结果说明, 通过该双元组分系统策略获得的转基因水稻具有明显的抗致病性真菌和一定程度的抗细菌危害的较广谱抗性.     

水稻条纹叶枯病毒分子生物学的研究——外壳蛋白分子量、氨基酸组成和N末端

水稻条纹叶枯病是水稻的主要病害之一,其病原为水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus,RSV)。RSV通过灰稻虱(Laodephax striatellus)等三种介体传毒,能侵染水稻、小麦、玉米等37种禾本科植物,引起严重减产。Koganezawa首次报道了RSV具有分枝线状结构,Toriyama提出RSV是三组分病毒,含有一种分子量为32000的外壳蛋白(CP)及4种单链RNA,最近他又在RSV颗粒中发现了相应的4种双链RNA。在我国水稻条纹叶枯病亦广