青岛文昌鱼hedgehog及两个hedgehog-like片段的克隆

采用RT-PCR方法获得了青岛文昌鱼2497bp长的hedgehog基因片段,其所编码的氨基酸序列与多种生物hh基因家族成员的相应片段显示了较高的同源性.同时获得2个含有部分hedgehog基因片段的序列hedgehog-like-1和hedgehog-like-2,提示文昌鱼中发生hedgehog基因倍增过程和有多拷贝hh基因存在的可能性.为研究hh基因的分子进化提供了线索.     

青岛文昌鱼发育信号传导相关基因hedgehog的克隆

hedgehog家族基因在动物胚胎多种发育过程的信号传导中起着关键作用.采用简并引物、套式PCR和RT-PCR方法获得青岛文昌鱼hedgehog基因片段,并对其所推测的氨基酸序列与hh基因家族成员小鼠Shh、Ihh、Dhh,鸡、爪蟾和斑马鱼Shh及果蝇hh等的相应片段进行同源性分析.它们的同源性分别为56％,53％,50％,53％,53％,53％和45％.研究结果支持文昌鱼具有1个,可能也仅有1个hedgehog家族基因.     

文昌鱼eIF5A基因的克隆和进化学分析

对文昌鱼神经胚cDNA文库进行测序和系统分析，首次从青岛文昌鱼(Brachiostoma belcheri tsingtauense)中成功得到1个eIFSA基因的cDNA序列，分析其推导的氨基酸序列揭示该基因产物具有eIF-5A家族蛋白质共有的保守区．对其二级结构进行预测，序列同源性分析表明eIF-5A家族基因在所有的真核生物中都高度保守．进化生物学的分析显示文昌鱼的eIF5A基因与脊椎动物的同源性较高，     

青岛文昌鱼hedgehog基因表达图式的研究

Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ｈｈ）家族基因编码一类分泌性信号分子,在果蝇的体节和成虫盘等的图式形成和脊椎动物脊索、神经管、体节和肢等的发育中起着关键作用。探讨原索动物文昌鱼ｈｈ基因的功能,对于研究脊椎动物发育机制的进化具有重要意义。本文报道了用整体原位杂交方法,研究不同发育时期文昌鱼胚胎和幼体ｈｈ基因表达图式的结果,并对文昌鱼ｈｈ基因的功能和ｈｈ家族同源基因功能的演化进行了讨论。文昌鱼ｈｈ基因在脊索和神经管     

文昌鱼内胚层发育相关核心调控基因的表达

研究了脊椎动物内胚层发育的核心调控基因Sox2,Pdx1和Cdx1在文昌鱼胚胎发育过程中的表达形式.结果显示:与脊椎动物相比,Sox2基因在文昌鱼前肠内胚层的表达区域具有较大的阴性范围,这一阴性区域与文昌鱼的鳃弓原基相对应,说明原索动物的内胚层衍生鳃弓与脊椎动物的神经脊鳃弓在演化上并不具备器官层次的同源性;文昌鱼Pdx1基因阳性的前-中肠消化内胚层的表达状态与脊椎动物高度同源,对应于盲囊的内胚层发育原基,说明文昌鱼盲囊与脊椎动物的胰腺具有演化同源关系;Cdx1基因的表达状态也与脊椎动物高度同源,说明脊椎动物的复杂肠道系统是从较为简单的后肠器官演化而来的.     

人基质细胞中新基因的获得及目的基因的克隆

取连续培养的骨髓基质细胞并提取其mRNA,合成cDNA后,收集＞400bp的片段,连接到真核表达载体pcDNA3.0上,构建人胎儿骨髓基质细胞真核cDNA质粒文库,并以PCR的方法从文库中扩增出编码人IL－6、SCF的基因序列,随机对文库克隆进行测序,得到了3个新基因EST,其中2个在GenBank的登录号分别为AF244998及AF244999。     

条斑紫菜丝状孢子体cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定

经过微量总RNA抽提、cDNA合成、cDNA扩增和克隆等步骤，构建了微量条斑紫菜丝状孢子体cDNA库，并进行了小规模表达序列标签分析。从170条标签序列中鉴定出6条抗病相关基因序列。这些序列可用于研制抗病单核苷酸多态性标记，辅助紫菜抗性遗传改良。     

青岛文昌鱼hedgehog基因表达图式的研究

Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ｈｈ）家族基因编码一类分泌性信号分子,在果蝇的体节和成虫盘等的图式形成和脊椎动物脊索、神经管、体节和肢等的发育中起着关键作用．探讨原索动物文昌鱼ｈｈ基因的功能,对于研究脊椎动物发育机制的进化具有重要意义．本文报道了用整体原位杂交方法,研究不同发育时期文昌鱼胚胎和幼体ｈｈ基因表达图式的结果,并对文昌鱼ｈｈ基因的功能和ｈｈ家族同源基因功能的演化进行了讨论．文昌鱼ｈｈ基因在脊索和神经管中的表达图式与脊椎动物Ｓｈｈ基因相似,其功能可能是介导脊索的诱导．     

盐藻磷酸甘油脱氢酶基因cDNA文库的构建

采用Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０载体构建了盐藻ｃＤＮＡ文库，文库大小为１０＾６／ｍＬ插入片段平均长度大于１ｋｂ。根据果蝇，兔，鼠编码其３－磷酸甘油脱氢酶基因的辅酶ＮＡＤ的结合功能区保守序列设计一对引物，大小分别为２１ｂｐ和１８ｂｐ。ＰＣＲ扩增得到与果蝇相同的２９０ｂｐ特异扩增片段，以该片段为探针，采用缺口平移系统标记原位杂交，从盐藻ｃＤＮＡ文库中获得３６个３－磷酸甘油脱氢酶基因的阳性克隆。     

文昌鱼研究在分子生物学时代再露头角

文昌鱼是世界珍稀海洋动物,被国家列为二级保护动物。1991年9月厦门市政府批准建立厦门文昌鱼自然保护区。1999年市政府将文昌鱼与另外两种保护动物中华白海豚、白鹭一起申报“厦门海洋珍稀物种国家级自然保护区”,2000年4月4日获得国务院的批准。所以,厦门不仅在地理位置上,因气候宜人环境优美为世人所赞羡,还在科学界,因是文昌鱼的重要产地而闻名于世。     

通过差减文库筛选山羊羔肠道淋巴集结特异表达基因

羊羔肠道淋巴集合淋巴结（Peyer's patch,以下简称PP）,是B淋巴细胞的主要来源地和发育、成熟场所,兼具中枢淋巴器官和周围淋巴器官的功能.采用抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）方法,构建山羊羔肠道淋巴集结与其非PP肠壁组织的差减 cDNA 文库,以期找到在山羊羔肠道淋巴集结中特异表达的与免疫相关的基因. 分别从山羊羔PP与非PP肠壁组织提取总RNA,反转录成cDNA,以PP作为待检组织(tester),非PP肠壁作为驱动组织(driver),经过两轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了两种组织间差异表达基因的差减cDNA文库. 对其中160个克隆测序,得到几个可能与免疫相关的基因,为进一步从中挑选和表达活性蛋白基因用于生产免疫增强剂奠定了基础.     

用差减cDNA文库筛选由热激导致的小鼠睾丸中差异表达的基因

采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）方法,构建正常和热激小鼠睾丸组织的差减 cDNA 文库,以期 筛选出小鼠生精过程中对热敏感的基因。分别从正常和热激小鼠睾丸组织提取总RNA,反转录成cDNA,以正常小鼠睾丸组织cDNA作为待检组织(tester),以热激小鼠睾丸组织cDNA作为驱动组织(driver), 经过2轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了2种组织间差异表达基因的差减cDNA文库。用半定量RT-PCR方法,进一步验证 了该文库中差减出的基因基本上为差异表达的基因。对随机挑选其中的932个克隆测序,对有效测序的565个基因序列与GenBank数据库中发布的序列进行同源性比较,大部分片段都可以检索到同源序列。 结果显示,cPGES/p23等13个基因热激后表达量上调;septin2等120个基因热激后表达量下调。其中cPGES/p23为本研究中首次发现的小鼠生精过程中对热敏感的基因。     

蟾蜍（Bufo japonicus）细胞溶素基因筛选用探针的制备

利用阴离子交换、凝胶过滤和高压液相柱层析对细胞溶素基因进行了纯化，获得了纯度极高的酶样品。经ｌｙｓｉｌ内肽酶进行定点酶切后，利用高压液相柱层析纯化出了该酶的多个短肽片段。其中，经测序获得了３个短肽片段的氨基酸序列。根据两栖动物中密码子的使用频率，可推测出其相应的ｃＤＮＡ的核苷酸序列，进而制备出了３个ｃＤＮＡ探针。利用这些合成的探针，便可从精子ｃＤＮＡ文库中筛选细胞溶素基因。     

青岛文昌鱼核糖体蛋白Amphil11基因的克隆和同源性分析

对青岛文昌鱼18小时神经胚cDNA文库进行测序，获得了5个AmphiL11的EST，经接接得到文昌鱼核糖体蛋白AmphiL11的编码完整的cDNA序列并演绎出AmphiL11的氨基酸序列，通过对AmphiL11蛋白的结构分析及其与人、鼠、鱼等脊柱动物和果蝇、线虫等无脊动物及酵母中同种核糖体蛋白的同源性分析，发现AmphiL11与脊柱动物核糖体L11蛋白的同源性很高，与高等无脊椎动物甚至酵母的同源性也较高，提示AmphiL11具有较高的进化水平，更接近于脊椎动物的核糖体蛋白L11。同时也表明，真核生物核糖体蛋白L11具有高度的保守性。     

文昌鱼酸性磷酸酯酶色氨酸残基的修饰

从厦门文昌鱼(Branchiostonia belcheri Gary)分离纯化获得聚丙烯酰胺胶电泳单一蛋白区带的酸性磷酸酯酶(EC3.1,3.2)应用化学修饰方法,荧光以及紫外-可见光谱的变化,探讨Trp残基与酶活力的关系,被NBS修饰的Trp基团仅有一个Trp残基被氧化时,酶活力丧失90％,该Trp残基为ACPase表现活力所必需,而且优先被氧化、从光谱扫描(230～600nm)结果表明,经NBS修饰以后的酶构象发生变化,文昌鱼ACPase的Trp残基和酶分子上的铁离子等基团均为酶活力的必需基团,推测两者可能以配位结合,共同维持酶活力中心的构象。     

植酸酶基因表达与调控机制研究(Ⅱ)──番茄幼苗cDNA文库构建与植酸酶基因筛选

采用异硫氰酸胍法从发芽３～４ｄ的番茄幼苗中提取出总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离纯化ｍＲＮＡ．以ｍＲＮＡ为模板,Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物用逆转录法合成双链ｃＤＮＡ．将ｃＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ接头连接后克隆到表达载体λｇｔ１１的单一ＥｃｏＲＩ位点,经体外包装后感染宿主菌Ｙ１０９０,成功地构建了完整的番茄幼苗ｃＤＮＡ文库．用颜色筛选法筛选重组子,然后用植酸酶抗体做探针进行免疫筛选,得到两个阳性克隆．挑取阳性克隆噬菌斑扩增后纯化ＤＮＡ,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,显示确有外源ＤＮＡ存在．该插入片断序列测定正在进行．     

3种文昌鱼的同工酶表型比较

采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳和生化染色方法比较白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)、日本文昌鱼(B.japonicum)和佛罗里达文昌鱼(B.floridae)的4种同工酶(苹果酸脱氢酶MDH、超氧化物歧化酶SOD、酯酶EST、淀粉酶α-AMY)的酶谱,结果显示4种同工酶酶带的数目、染色深浅及迁移率在3种文昌鱼之间的差异比较明显,可作为鉴定不同种文昌鱼的依据,但同种文昌鱼的雌雄之间以及性腺成熟前后的同工酶酶谱的差异不明显.     

日本血吸虫CDNA文库的构建及功能性抗原基因的克隆、筛选和鉴定

采用一步法提取MRNA及定向克隆技术,构建了日本血吸虫(中国大陆株)CDNA文库;应用多种不同特色的血清以免疫学方法筛选文库;系统的报道了日本血吸虫22.6KD基因克隆和在大肠杆菌中的高效表达、分离纯化、免疫原性及特性分析,填补了国内空白.     

文昌鱼体表粘液凝集素的初步研究

文昌鱼体表粘液经卵粘蛋白 -Sepharose 6B亲和层析法分离出一种凝集素 (AmphioxusMucusLectin ,简称AML) .该凝集素能凝集兔及人的红血细胞 ,无血型专一性 ;其凝血活性不依赖于Ca2 和Mg2 ,在 pH6-1 0范围较稳定 ,经 60℃保温 1 0min活性则完全消失 ;SDS PAGE测得其亚基分子量为93 0 0 0 ;含糖量为 2 6% .文昌鱼凝集素在文昌鱼的免疫防卫中可能起着重要作用 .