产中性蛋白酶工程菌的构建及其发酵条件的初步优化

为构建1株产中性蛋白酶的工程菌株并对其发酵条件进行优化,以中性蛋白酶工业生产菌株枯草芽孢杆菌AS1.398的基因组为模板,采用PCR技术扩增获得中性蛋白酶基因npr,与高拷贝质粒pWB980连接并转入蛋白酶缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB600中得到重组工程菌WB600/pWB980-npr.在初筛平板上工程菌蛋白酶活力明显高于工业生产菌AS1.398,工程菌发酵活力可达1,398.3,U/mL.通过对其发酵工艺进一步优化,在接种量5%、装液量100,mL/500,mL、摇床转速180,r/min、温度34,℃的条件下发酵48,h,发酵液的酶活力可达2,487.5,U/mL,比优化前提高了78%.     

重组葡激酶的高效表达与纯化

通过发酵和纯化条件的研究,建立适合重组葡激酶工程菌的发酵和纯化工艺.对重组葡激酶工程菌发酵过程中的pH、饱和氧浓度、补料以及诱导时间进行考察,获得该工程菌的高效表达条件.在此条件下,重组葡激酶表达水平在50%以上,并以活性可溶性状态存在于细胞内;经渗滤,超滤浓缩、透析,DEAE-Sepharose FF层析和SP-Sepharose FF层析后,经SDS-PAGE和HPLC分析,纯度达到99%.在还原条件下进行SDS-PAGE分析,测得该酶相对分子质量为15.5kD,等电聚焦显示其等电点为8.4.     

一种适合于溶葡球菌酶发酵生产和分离纯化的半合成培养基的建立

利用含溶葡球菌酶基因的枯草芽孢杆菌转化子进行半合成培养基的发酵试验，结果表明：该半合成培养基适合于枯草芽孢杆菌生长，色素极微。半合成培养基蛋白总量是ＦＤ培养基的１／２４。用半合成培养基摇瓶发酵１４ｈ后，产酶量在（３７０±２６）ｍｇ／Ｌ．表明该培养基将有利于溶葡球菌酶的分离纯化，是溶葡球菌酶发酵生产的一个理想培养基。     

重组锰超氧化物歧化酶工程菌摇瓶发酵条件的优化

通过单因素试验对重组锰超氧化物歧化酶(Recombinant Manganese Superoxide Dismutase,rMn-SOD)工程菌的摇瓶发酵的培养基(碳源、氮源、无机盐)和培养条件(接种量、乳糖浓度、时间、温度、摇床转速、pH值等)进行了初步优化.结果表明,工程菌发酵的优化培养基组分(质量分数)为:1.5%蛋白胨、1.5%酵母提取物、1.0%NaCl、0.4%KH2PO4、0.8%K2HPO4、1.5%(体积分数)甘油、0.2%NH4Cl和5 mmol/L MnCl2.乳糖诱导表达的优化条件为:以5%接种量培养5 h后,加入质量分数为0.25%的乳糖进行诱导表达6 h.当发酵温度为37℃、摇床转速为180 r/min、培养基的初始pH值为7.0时,表达的rMn-SOD的酶活力高.在优化条件下,工程菌的SOD活性达1 969.9 U/mL,比活力达1 081.8 U/mg.     

LHRH-PE40工程菌发酵条件的初步研究

利用摇瓶在温度、pH范围、诱导剂量及诱导时间等不同因素变化时，进行了重组毒素LHRH-PE40工程菌发酵条件的初步探索.结果表明，工程菌优化的发酵条件为：pH范围7．3～7．5，诱导温度为34℃．诱导时菌密度A600=0．8，诱导时间为4～4．5h，诱导剂(IPTG)浓度为0.5mmol/L。     

重组鲑鱼降钙素融合蛋白工程菌发酵工艺研究

为研究大肠杆菌表达重组鲑鱼降钙素融合蛋白(GST-sCT-Gly)工程菌的发酵工艺,采用瑞士比欧生物工程公司40 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行优化;在优化条件下,以40 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达到57 g/L,目的蛋白表达量占总蛋白的23.5%;结果表明,研究确定的发酵工艺可以提高工程菌收获量及目的蛋白的表达量,且稳定可靠,可应用于生产。     

D-核糖产生菌的选育及发酵

以枯草芽孢杆菌Ｄ－２为出发菌株,经紫外诱变,得到一株莽草酸缺陷型突变株Ｄ－２０２,摇瓶发酵Ｄ－核糖产量可达到５２．６ｇ／Ｌ。该菌遗传稳定性良好。通过发酵条件的优化,最高产量可达６５ｇ／Ｌ。经２ｔ发酵罐中试,发酵单位达到５０ｇ／Ｌ。     

利用枯草芽孢杆菌发酵生产糖化酶的上游工艺研究

糖化酶-α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucan glucohydrolace),又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)],此酶作用于淀粉分子的非还原性末端,以葡萄糖为单位,依次作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖。此酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1,6-糖苷键的寡糖;作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。本产品广泛用于生产白酒、黄酒、酒精、啤酒;用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵;本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之,凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上,都可适用。糖化酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉等经深层发酵提炼而成,本文介绍的是利用枯草芽孢菌杆发酵来生产糖化酶的基本上游工艺过程。     

La(Ⅲ)的抑菌作用研究

进行了La()抑菌实验,采用比浊法、平板计数法、滤纸片法对大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphulococcusaureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)进行了测定.结果表明:所用抑菌物对供试菌均有不同程度的抑制作用,当La()的浓度为1.0×10-6~1.0×10-4mol/L时抑制作用最明显,且随着La()离子浓度增大,抑菌作用趋势增强.     

枯草芽孢杆菌BS-6液体发酵条件的研究

通过单因素实验和正交实验,研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-6的液体发酵培养基和工艺条件,确定最佳的培养基为:蔗糖3%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%,KH2PO4 0.45%,(NH4)2SO40.25%,碳酸钙0.2%;最适发酵条件为:温度30℃,pH值7.0,装量20ml/250ml锥形瓶,转速200r/min。     

葡激酶突变体Y1-Sak的体外变复性研究

具有低免疫原性的双功能葡激酶突变体Y1-Sak(△15,S16K,K74A,E75A,R77A,K109R,F111D)在大肠杆菌中的表达产物为包涵体,必须进行体外变复性才能得到活性.详细研究了复性方式、pH、温度、复性的初始蛋白浓度和添加L-精氨酸对Y1-Sak的体外变复性的影响,发现复性温度和添加的L-精氨酸对Y1-Sak的复性有重要的影响.经过工艺优化后,Y1-Sak的纯化活性回收率达到40%左右,蛋白比活性由20 kU/mg提高到53 kU/mg.用动态光散射分析发现,工艺优化后复性的高比活性Y1-Sak的水合动力学半径与野生型葡激酶相近,分子基本处于单体状态.     

重组葡激酶突变体K35R纯化过程中宿主菌菌体蛋白残余量的免疫分析

葡激酶突变体K35R(DGR)是双功能葡激酶突变体,是正在开发的治疗血栓性疾病的新药.为检测DGR纯化过程中宿主菌菌体蛋白的残留,建立了宿主菌菌体蛋白的免疫分析方法.用所制备的宿主菌菌体蛋白免疫新西兰兔,得到菌体蛋白的抗血清.使用SDS-PAGE和基于抗血清的免疫印迹方法检测DGR纯化过程中菌体蛋白的去除.进一步建立了对宿主菌菌体蛋白灵敏的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,其检测线性范围是5～100μg/L,并用ELISA法定量测定了纯化过程中中间产物和纯化产品中菌体蛋白的含量.     

γ干扰素工程菌发酵工艺研究

在摇瓶培养及恒化培养研究的基础上,对含温度敏感型质粒γ干扰素工程菌高密度、高表达的发酵工艺作了探讨。摇瓶培养结果表明,菌体的良好生长状态对外源基因表达起着重要作用,工程菌于对数后期升温,干扰素滴度最高。以葡萄糖为限制性基质的恒化培养,得出了工程菌细胞生长得率与比生长速率之间的关系,同时表明工程菌升温表达前的比生长速率对表达后干扰素的比活有影响,比生长速率在0.10～0.15h~(-1)时比活最大。通过碳、氮、镁的间歇流加培养与连续流加培养,均使工程菌达到高密度与高表达,但以控制比生长速率为目的的连续流加培养较间歇流加比活提高近4倍,棕1.1×10~(10)IU/L。     

金霉素产生菌F—303的选育及发酵特性

以金霉素产生菌H-502作为出发菌株,采用紫外线加氯化锂作为复合诱变剂,通过生物技术手段获得了F-303变株。投产结果表明,该复株具有孢子萌发率高,发酵周期短,发酵单位高和放罐体积大的特点,发酵指数超过国际先进水平。     

关于产生细胞分裂素的紫云英根瘤菌突变株发酵条件的探索

紫云英根瘤菌[Rhizobium sp(Atragalus)突变株在修改后的化学合成培养基和液态常规培养基上都能正常生长,而且分泌细胞分裂素的量都是在菌体生长的稳定期为最大。但以化学合成培养基为更适宜。菌体在其上生长,产生的细胞分裂素更多。培养基的碳源以10g/l甘露醇为宜。氮源以0.5g/l NH_4NO_3和0.75g/l尿素为宜。     

温度对重组大肠杆菌生长及外源蛋白表达的影响

对重组大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）发酵生产rhCu/Zn-SOD的诱导温度进行了优化，考察了37℃和30℃下重组菌的生长规律及产物表达。在5L自控发酵罐中的发酵结果表明：较低温度时菌体的比生长速率较低，菌体活性与质粒稳定性有很大程度的改善，外源蛋白稳定性与可溶性也有一定的提高；30℃诱导时rhCu/Zn-SOD的酶活性最高，每毫升发酵液的酶活力为4757U，约为37℃诱导时的2.7倍。     

四苯基(2-硝基)卟啉配合物的合成和性质

报道了用Adler方法合成四苯基(2-硝基)卟啉(简称TP(2-NO_2)P)的Co、Ni、Mn金属配合物。用元素分析、紫外可见光谱、红外光谱、核磁共振、顺磁共振等方法表征了配合物的组成和结构。用光谱滴定法研究了配合物与含氮有机碱的加合反应和性质。     

生物制氢系统产氢菌的富集培养与分离技术

从生物制氢反应器中富集、分离培养发酵产氢细菌并发挥其最大产氢能力,可以提高高浓度有机废水制氢系统的产氢性能。采用活性污泥混合培养发酵反应器和设计培养基研究产氢菌的富集培养和分离。将连续流发酵法生物制氢系统的运行参数调整如下：pH值为4．0～4．2,温度为35～38℃,氧化还原电位（ORP）为-100mV,反应器运行40～50d,使之达到产氢最佳的乙醇型发酵阶段,初步富集以产氢菌为优势群落的活性污泥;以葡萄糖、果糖和麦牙糖为碳源,以蛋白胨和牛肉膏为氮源,设计HPB—LR培养基,严格厌氧条件下,可以有效地富集培养产氢发酵细菌。采用改良Hungater技术、厌氧管斜面法和平板培养瓶厌氧技术等3种厌氧培养技术分离培养产氢菌效果最佳。获得产氢菌94株,这些菌株经过筛选鉴定,获得3株高效产氢菌。这些菌株为发酵法生物制氢工程提供了宝贵的微生物种质资源。     

泥炭好食性链孢霉固体发酵饲料的研究

通过对泥炭原料、生产菌种、培养条件和后加工工艺路线的优选，建立了我国第一条年产３０００吨泥炭固体发酵饲料的工业生产线。利用草本泥炭等原料，采用选育的好食性链孢霉固体发酵制成饲料，其粗蛋白可达１８％以上。经毒理测定和喂养试验表明，安全无毒，动物喂养效果好，并能以泥炭取代部分精饲料，节约粮食，符合国情，“两效益”显著，易于推广应用。