表达EGFR与HER2双抗体融合蛋白腺病毒载体研究

构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力.通过PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2一Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法(IFA)检测所表达的融合蛋白与EGFR(+)Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2(+)的SK-OV-3细胞膜结合的特异性.ELISA检测分析表明,AdS-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/mL-317.3 ng/mL;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合.成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-Herin,而且AT2-Herin蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合.     

表达EGFR与HER2双特异性抗体融合蛋白腺病毒载体的构建及表达

目的：构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸（Herin）融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力。方法：通过合拉PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸（Herin）的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2-Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法（IFA）检测所表达的融合蛋白与EGFR( )Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2( )的SK-OV-3细胞膜结合的特异性。结果：ELISA检测分析表明,Ad5-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/ml-317.3 ng/ml;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合。 结论：成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-HERIN,而且AT2-HERIN蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合。     

靶向EGFR的siRNA有效抑制小鼠肺癌移植瘤的生长

采用RNA干扰技术来研究靶向EGFR的siRNA对肺癌皮下移植瘤生长的影响.化学合成了3条针对EGFR的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染不同的EGFR siRNA后,A549细胞(高表达EGFR)EGFR的mRNA和蛋白表达均有显著降低,其中EGFR siRNA_1的沉默效果最为明显.转染EGFR siRNA_1后A549细胞的凋亡率明显增加,增殖活性明显降低.最后,利用稳定表达荧光素酶报告基因的人肺腺癌细胞株(A549-luc)建立裸鼠皮下移植瘤模型,采用活体动物体内光学成像系统实时检测以及通过检测肿瘤体积来检测对照组和EGFR siRNA_1给药组移植瘤的生长情况,结果发现EGFR siRNA_1治疗组肿瘤的生长速度较空白对照组和Notarget siRNA对照组明显变慢,说明干扰EGFR基因表达对肺癌皮下移植瘤的生长具有明显的抑制作用.     

FBXO6稳定表达肿瘤细胞系的构建及其亚细胞器定位

检测FBXO6在多种肿瘤细胞中的表达和定位情况并构建稳定表达FBXO6的肿瘤细胞株。运用RT-PCR方法,在人胚肾293T细胞以及9种不同来源的肿瘤细胞中,检测了FBXO6的表达情况。以载体质粒pBabe-3Flag-FBXO6-puro/pBabe-3Flag-con、包装质粒pCMV-GAG-POL及包膜质粒pCMV-VSVG用Lipofectamine2000共转染包装细胞系293T,收集病毒颗粒感染A549细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定FBXO6的表达。利用激光共聚焦荧光显微镜,采用间接免疫荧光方法,检测外源性FBXO6在A549中的亚细胞定位。在10种不同来源的细胞株中,FBXO6在A549细胞中的表达最高。成功筛选出嘌呤霉素抗性细胞系A549-Con与A549-3Flag-FBXO6。Western blot方法发现A549-3Flag-FBXO6细胞系稳定表达FBXO6蛋白。间接免疫荧光发现FBXO6与内质网tracker有共定位。FBXO6在肺癌A549细胞中高度表达,构建了稳定表达FBXO6的A549细胞系,部分FBXO6分布在内质网中。     

E-cadherin 启动子的荧光示踪体系的建立及验证

为实现对肺癌 A549 细胞的EMT 示踪,构建了 E-cadherin 基因启动子的慢病毒质粒,并与包装质粒pVSVG、Δ8.91 共转染 HEK293T 细胞,包装成有活性的慢病毒,收取病毒感染 A549 细胞,利用流式细胞仪和 Western blot 检测感染成功. 进一步用 TGF-β 诱导感染成功的 A549 细胞,通过在荧光显微镜下观察荧光变化、荧光定量 PCR 和 Western blot 检测GFP 和E-cadherin 的变化,发现在 TGF-β 诱导 48 h 后,A549 细胞形态由鹅卵石样变成长梭形. 并且荧光显微镜观察到相比较于未诱导的细胞,诱导后的A549 细胞绿色荧光明显变暗,同时 GFP 和 E-cadherin 的 RNA 水平和蛋白质表达水平均降低. 以 E-cadherin 基因启动子为基础建立了A549 细胞的EMT 荧光示踪体系,为进一步研究肺癌的 EMT 过程提供了材料.     

肿瘤特异性溶瘤腺病毒载体的构建及其在肿瘤细胞中特异性的表达

为构建一种由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)调控的能够在肿瘤细胞中特异性增殖的新型肿瘤基因治疗溶瘤腺病毒载体系统,利用基因重组技术将hTERTp插入5型腺病毒E1A基因上游,构建肿瘤特异性增殖腺病毒AdSU,使其携带绿色荧光蛋白报告基因.同时构建增殖缺陷型腺病毒Ad-EGFP作为对照.通过Westem blot分析表明该特异性增殖腺病毒AdSU-EGFP在肿瘤细胞中特异性表达EIA.而通过荧光显微镜观察两者增殖实验发现,AdSU-EGFP在正常成纤维细胞株BJ及原代子宫成纤维细胞中无增殖,在肝癌细胞株MH-CC和肺癌细胞株A549中,则可见病毒增殖并裂解细胞的现象.由此可认为成功构建了肿瘤基因治疗的特异性溶瘤腺病毒载体系统AdSU,该系统能够在肿瘤细胞中特异性增殖并表达所携带的外源基因,这对肿瘤的定向基因治疗有着重要意义.     

免疫磁珠检测食品中金黄色葡萄球菌的研究

通过对金黄色葡萄球菌免疫磁珠添加量、免疫磁珠与菌液最佳反应时间、免疫磁珠分离金黄色葡萄球菌的敏感性试验、特异性试验的研究,确定了金黄色葡萄球菌抗体添加量50μg/m L、免疫磁珠添加量100μL,免疫磁珠与菌液最佳作用时间为30 min,免疫磁珠法检测灵敏度底限为10-9,相应的细菌浓度为14 cfu/m L.本试验制备的免疫磁珠灵敏性强,特异性高,大大节省了检测时间和费用.因此研究食品中金黄色葡萄球菌快速、准确检测方法以预防和控制食品安全事件的发生,具有重要的现实意义.     

肺癌A549细胞COX-2与MMP-2表达的关系

目的:探讨肺癌A549细胞环氧化酶-2(COX-2)表达和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达之间可能潜在的关系.方法:①用Western blot法检测对照组和干预组(5、10、15μg/mL脂多糖(LPS)干预12 h,10 μg/mL的LPS干预6、12、24 h)A549细胞MMP-2蛋白质表达;②用ELISA法检测对照组和干预组A549细胞培养上清液COX-2活性产物前列腺素E2(PGE2)及MMP-2的变化.结果:①在5、10、15μg/mL的LPS 12 h诱导下,肺癌A549细胞MMP-2蛋白表达及MMP-2和PGE2的分泌增加;②10 μg/mL的LPS干预肺癌A549细胞6、12、24 h后MMP-2蛋白表达及MMP-2和PGE2的分泌增加;③肺癌A549细胞PGE2与MMP-2正相关(r1=0.980,r2=0.975).结论:①肺癌A549细胞PGE2与MMP-2密切相关;②肺癌A549细胞可能通过激活肺癌A549细胞MMP-2,参与肺癌的侵袭与转移.     

人参皂甙Rh2和桦木酸协同诱导A549细胞凋亡的研究

我们已经发现,天然成分人参皂甙Rh2(G-Rh2)和桦木酸(Bet A)能够协同作用诱导人源肺癌A549细胞死亡.通过细胞形态观察、流式细胞检测分析、酶活性测定、免疫印记分析等实验技术,从细胞和分子水平提供证据,证明了G-Rh2和Bet A协同诱导A549细胞死亡的过程为细胞凋亡作用,且涉及线粒体途径.     

茶硝香酰胺联合吉非替尼对人非小细胞肺癌迁移的影响

本实验旨在探究茶氨酸衍生物茶硝香酰胺(TNC)和吉非替尼联合是否增强吉非替尼对人非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响与其可能作用的分子机制,为抑制肺癌远处转移和减少吉非替尼毒副作用提供新思路.采用细胞划痕术检测联合用药前后细胞迁移能力变化;上皮-间质转化(EMT)诱导实验结合Transwell实验观察发生EMT后A549迁移能力改变;蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达.结果显示:TNC联合吉非替尼可显著抑制A549细胞迁移,且间质标志物N-Cadherin、Vimentin显著下调,上皮细胞标志物E-Cadherin明显上调,与迁移相关转录抑制因子ZEB、Slug、Snail、Twist表达显著下降,同时AKT、NF-κB等蛋白表达水平下调.提示TNC联合吉非替尼可能是通过抑制A549细胞的EMT过程从而增强吉非替尼对A549细胞迁移的抑制作用.     

柿子叶有效部位的抗肿瘤活性研究

以柿子叶为研究对象,采用70%乙醇回流提取柿子叶的有效成分。提取物浓缩后加水搅拌,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四种溶剂进行梯度萃取,浓缩各相,加上乙醇粗提物共得到六种干燥浸膏。采用CCK试剂检测法,测定六种浸膏对两组癌细胞人宫颈癌细胞Hela、肺癌细胞A549和正常细胞人肾上皮细胞293的生长抑制作用。结果表明,六种浸膏均具有较强抗肿瘤活性,其中二氯甲烷层和正丁醇层对Hela细胞抑制活性最好,其IC₅₀分别为0.24、0.26 mg/mL,A549细胞则对乙酸乙酯层更为敏感,其IC₅₀值低至0.03 mg/mL。此外,六种浸膏对正常人肾上皮细胞293也显示出明显的抑制作用,尤其是乙酸乙酯层,IC₅₀值达到0.93 mg/mL。研究证实了柿子叶具有明显抗肿瘤活性,且其活性成分复杂,在各相中均有分布,但又对不同细胞株活性各有差异,提示在后续的活性追踪中可以根据活性需求,选择恰当的柿子叶有效部位进行研究。     

胡桃醌含药血清体外抗肿瘤实验研究

研究胡桃醌(Juglone)含药血清对人肺癌A549细胞的生长抑制作用及对细胞周期的影响. 以血清药理学原理为基础,通过MTT法检测胡桃醌对A549细胞的生长抑制作用,并筛选最佳药物浓度;利用流式细胞仪分析胡桃醌对A549细胞周期的影响,并用Western blot验证. 实验结果表明,胡桃醌的半衰期T_1/2=136 min,MTT法显示其对体外培养的人肺癌A549细胞具有明显抑制作用,比较12,24,48 h细胞存活率得出10%高剂量组(0.107 μg/mL)胡桃醌血清抑制作用较好,同时,胡桃醌可通过凋亡途径阻滞细胞于S期,增加caspase-3的表达. 胡桃醌对A549细胞可能具有生长抑制作用,将细胞阻滞在S期,诱导细胞凋亡,上调caspase-3表达量.      

通管汤盆腔灌注对大鼠输卵管炎性阻塞性不孕模型病理及BCL-2、EGFR蛋白表达的影响

目的研究自拟通管汤(简称通管汤)盆腔灌注对大鼠输卵管炎性阻塞的作用及机制。方法选用体重为(200±20)g,鼠龄8~12周的SD雌性大鼠130只,用混合菌制造大鼠输卵管炎性阻塞模型114只,随机分为正常对照组(A)、模型组(B)、兔耳风胶囊组(C)、通管汤组(低剂量组D_1、中剂量组D_2、高剂量组D_3)。采用输卵管通液观察输卵管通畅,HE染色观察输卵管组织形态学变化,免疫组化检测输卵管上皮细胞Bcl-2、EGFR的表达。结果 (1)治疗组输卵管通畅率D_3、D_2、C组与B、D_1组比较有非常显著性差异(P0.01);(2)D_3组与D_2、C组比较有较显著差异(P0.05);中高剂量治疗组(D_3、D_2)输卵管组织形态好转明显好于模型组(B)与低剂量组(D_1);治疗组输卵管上皮细胞Bcl-2、EGFR表达(P0.05-P0.01),差异有显著性,15 d与30 d比较无明显差异。结论通管汤高剂量组能缓解输卵管肿胀、减轻炎性细胞浸润、增加管腔纤毛数量和恢复输卵管通畅性;并通过下调Bcl-2、EGFR的过度表达,抑制输卵管上皮细胞凋亡和炎症反应,达到治疗输卵管炎性阻塞的作用。     

候选药物TW918对K-Ras突变型人肺腺癌A549细胞的体外抑制作用

探讨候选药物TW918对K-Ras突变型人肺腺癌A549细胞的体外抑制作用.以MTT法检测TW918对A549细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测A549细胞周期和凋亡的变化;Western blotting 检测相关蛋白的表达.结果表明:候选药物TW918可以以时间和剂量依赖性地抑制A549细胞的增殖,且作用72 h时抑制效果比吉非替尼高9.93倍;引起细胞周期阻滞于G1期,并诱导细胞发生凋亡;降低A549细胞中p-EGFR的表达,并抑制其下游PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活.TW918对K-Ra     

HRP标记的二抗检测heme结合蛋白造成假阳性问题的探讨

为了验证对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)作为二抗标记物在检测heme结合蛋白时产生假阳性问题的推测,以菠菜细胞色素b_6f复合体(Cyt b_6f)和铁氧还蛋白-NADP~+氧化还原酶(FNR)为检测对象(前者含有heme结合蛋白Cyt f,后者不含heme基团),采用菠菜FNR一抗、HRP和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)标记的二抗,设计对比实验。结果表明,在使用HRP标记的二抗体系中,Cyt f不经一抗和二抗孵育即可显色,这是明显的假阳性;而在ALP标记的二抗体系中,Cyt f条带不显色,只有FNR条带显色。在western blot实验中,如果被检测蛋白为heme结合蛋白或者混有少量heme结合蛋白,应避免采用HRP标记的二抗,建议使用ALP标记的二抗或者其他二抗产品;heme结合蛋白具有类似HRP的氧化还原酶活性,其本身可以和显色液反应,从而产生假阳性,干扰对实验结果的判断。     

Au@SiO2 core/shell nanoparticle-decorated TiO2 nanorod arrays for enhanced photoelectrochemical water splitting

To improve the separation efficiency of photoinduced charge carries,Au@SiO2nanoparticles(NPs)with core–shell structure were loaded onto the surface of TiO2nanorods grown on fluorine-doped tin oxide substrate by a facile two-step process.The resulted Au@SiO2/TiO2photoanodes were characterized by X-ray diffraction,scanning electron microscopy,transmission electron microscopy,as well as photoelectrochemical measurements.Compared with pristine TiO2nanorod film,the Au@SiO2/TiO2films showed remarkable enhancement in photoelectrochemical water splitting,with incident photonto-current conversion efficiency increasing from 31%to37%at 380 nm at 0.7 V versus saturated calomel electrode.This could be interpreted by the effect of metallic surface plasmon resonance of Au@SiO2NPs,which would generate an intense electromagnetic field with spatially nonhomogenous distributed intensity.As a result,the charge carriers generated in the near-surface region of TiO2nanorods could be easily separated.This modification method based on the effect of metallic surface plasmon resonance for promoted charge carrier separation provides a promising way to develop semiconductor photoelectrodes with high solar water-splitting performance.     

人肺腺癌细胞A549低温保存优化研究

人肺腺癌A549细胞广泛用于体外肺癌发病基因筛查、药物筛选等临床研究,低温保存是保持样本库中的A549细胞高质量的有效方法。本文针对A549细胞低温保存方法,通过使用非接触置核慢速降温程序减小降温过程中溶液的过冷度,并在此基础上优化保护剂乙二醇（ethylene glycol,EG）、二甲基亚砜（dimethyl su...     

SLC38A3抗体的制备及细胞内定位

从人胎肝cDNA文库中钓取得到SLC38A3全长cDNA序列.利用生物信息学方法对SLC38A3蛋白序列进行分析,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择一段多肽序列作为抗原用于抗体制备.将该片段克隆到pET-DsbA融合蛋白表达载体上,在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下产生SLC38A3抗原肽.纯化目的蛋白并制备兔抗SLC38A3蛋白的多克隆抗体.利用Western blot鉴定抗体特异性,并初步分析该蛋白在人肺癌细胞A549内的定位.结果显示,成功构建了SLC38A3片段的原核表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,制备了特异性较高的人SLC38A3蛋白多克隆抗体,并证实该蛋白表达于细胞质内.为进一步研究SLC38A3的生物学功能奠定了基础.     

3D printed titanium scaffolds with ordered TiO2 nanotubular surface and mesoporous bioactive glass for bone repair

Titanium alloy scaffolds have recently gained substantial interest for the treatment of critical-size bone defect, particularly along with the maturity of the 3D printing technology that is capable of turning scaffold design ideas into real implants. As titanium alloys lack surface osteogenic activity, for improved biological performance of such scaffolds, surface modification is necessary. Various coating materials and coating methods have been explored. In this study, we developed a unique surface modification method to provide the surface of 3D printed titanium scaffolds with nano-sized structure and bioactive agent. Uniform, ordered TiO₂ nanotube arrays were formed by applying two-step anodization, and then mesoporous bioactive glass (MBG) was loaded into nanotubes. The results of in vitro immersion testing showed that bioactive ions, i.e., Si and Ca ions, could be steadily and continuously released from MBG into basal medium. The assessment of the responses of hBMSCs confirmed that the surface-modified scaffolds supported the adhesion and proliferation of hBMSCs, indicating good surface cytocompatibility. The developed method of combining surface nanostructure and bioactive agent could be used as a new strategy to improve the osteogenic activity of 3D printed titanium alloy scaffolds.