黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。     

氧化亚铁硫杆菌Tf-55基因文库的构建

以λEMBL_3噬菌体 DNA作为载体,用BamHI/EcoRI双酶切后,与Sau3AI部分酶切的氧化亚铁硫杆菌Tf-55染色体10～23Kb DNA片段连接,体外包装成重组噬菌体,所得重组子为6×10~4Pfu(噬菌斑形成单位)达到了建库要求的理论值。并用酶切分析及分子杂交的方法对该库进行了验证。     

水稻农虎26B保持系线粒体基因文库的构建

经Sau3AI部分酶解并脱磷的水稻农虎26B保持系的线粒体DNA与BamHI/EcoRI双酶切的λEMBL3AB载体DNA进行了连接,对连接物进行了体外包装,并感染NM538和Q359受体菌,得到了1.75×10~4个重组子.从中随机选取5个克隆的DNA,用BamHI进行酶切,琼脂糖凝胶电泳,出现了不同于载体DNA的酶切带型.另随机选取3个克隆的DNA,均与水稻线粒体DNA发生了杂交.由此认为,水稻农虎26B保持系线粒体基因文库确已建立.     

毛尖紫萼藓GpPOD基因克隆及其表达载体的构建

本实验室已成功构建毛尖紫萼藓干旱胁迫cDNA文库。从中选取与抗旱相关的过氧化物酶基因,命名为GpPOD。通过RACE技术克隆获得序列全长。采用RT-PCR方法克隆GpPOD基因,连接到pMD-18T simple载体上,构建克隆载体pMD18T-GpPOD,将其插入表达载体PRI101-AN中,构建表达载体PRI101-GpPOD,然后将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中。重组质粒pMD18T-POD、PRI101-POD的DNA测序结果与原序列相似性高达99%,证明GpPOD基因成功连接到pMD-18T simple载体上,并已克隆到表达载体PRI101-AN中;农杆菌转化后的PCR电泳图谱在约581 bp左右得到清晰条带,证明重组质粒PRI101-GpPOD已成功转入农杆菌中。本实验为后续研究GpPOD基因的遗传转化奠定了良好基础。     

应用核型多角体病毒载体在家蚕和家蚕培养细胞中高效表达人尿激酶原cDNA基因

将人尿激酶原(pro-UK)cDNA分别插入家蚕核型多角体病毒转移载体pBK283和pBF4中,构建成两个重组质粒。所构建的这两个重组质粒与野生型家蚕核型多角体病毒DNA(BmNPV genomic DNA)共转染家蚕培养细胞,经病毒斑实验(Plaque assay)筛选出含pro-UK cDNA的稳定重组病毒株BmNPV-pk1和BmNPV-pk2。将此两株重组病毒分别感染家蚕培养细胞和家蚕幼虫4天后,用酶联免疫测定法(ELISA),纤维蛋白平板溶圈测活法和Western印迹法分析细胞培养上清及细胞和家蚕的体液及组织,证实均有pro-UK表达。家蚕培养细胞的表达量分别为0.0012mg/mL(上清液和10~6细胞)和0.0031mg/mL(上清液和10~6细胞),家蚕幼虫体液的表达量分别为0.0100mg/mL和0.0300mg/mL。从以上结果可看出,家蚕幼虫体液的表达量是培养细胞的10倍,以上表达产物在纤维蛋白平板上测活均有溶纤活性。     

用于骨移植的hCbfa1重组腺病毒载体的构建

克隆hCbfa1的cDNA基因,构建其重组腺病毒载体,以用于研究hCbfa1腺病毒载体在人造骨移植中的作用.将hCbfa1的cDNA目的片段插入腺病毒柯氏质粒PAxCAwt中,再将此质粒与腺病毒DNA末端蛋白复合物共转染293个细胞,通过同源重组构建hCbfa1重组腺病毒载体.重组得到的阳性克隆经酶切、测序鉴定正确,包装纯化后,检测得病毒滴度为2×109PFU/mL,从而成功地构建了hCbfa1重组腺病毒载体,为下一步应用到人造骨移植的转基因治疗打下了基础.     

杉木茎段形成层组织cDNA文库的构建

为了分离和克隆与杉木木材形成相关的重要基因,笔者以杉木2~3年生枝条,5~6月份形成层活动期的茎段形成层组织为材料,用表达型噬菌体载体ZAP构建了cDNA文库。文库宿主菌为E.coliXL1-Blue,亚克隆空菌为E.coliXLOLR。试验结果表明:初级文库的库容量达到6.1×105pfu,扩增文库的滴度达到5.2×109pfu/mL,重组率达到95%,插入片段大小在0.5~3.0 kb。     

人胰岛素原DNA疫苗的构建与鉴定

构建1型糖尿病关键自身抗原胰岛素原（Proinsulin）的DNA疫苗,并在体外对其表达产物进行鉴定。从人胰腺cDNA库用半巢式PCR扩增出编码Proinsulin的cDNA,克隆入载体PGEM－T中,再将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组载体pcDNA3.1( )／Proinsulin,测序后在真核细胞COS－7中进行体外短暂表达,Western印迹法对其表达产物进行鉴定。结果克隆的人Proinsulin基因,测序表明其cDNA序列与Genbank公布的序列基本相同,仅在第63位氨基酸（C肽区）有一CAG（Glu)→CGG（Arg）的突变,Western免疫印迹法证实DNA疫苗在COS－7细胞中有效地获得了表达。结果说明运用基因克隆方法构建的Proinsulin DNA疫苗,在真核细胞内能有效地表达Proinsulin重组抗原。该疫苗的构建成功,为1型糖尿病的免疫干预提供了实验基础。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

T7噬菌体文库构建中载体制备及连接条件的优化

目的分离纯化T7噬菌体DNA并构建T7select10-3b载体.方法用酚和氯仿:异戊醇(24:1)提取得到T7噬菌体DNA.用EcoRI和HindIII对T7DNA进行双酶切 ,得到载体的左臂和右臂.最后通过试剂盒从琼脂糖凝胶中回收载体的左右臂,用紫外分光光度计测定其纯度.与外援片段连接后进行体外包装.结果构建得到T7select10-3b载体 ,载体的左右臂大小分别为19kb和16kb,并成功包装成噬菌体颗粒.结论本方法适合大量提取纯化T7DNA和T7select10-3b载体,得到的载体可用于构建cDNA文库等其它基因工程的操作.     

高质量水稻基因组文库构建的策略和方法

采用改良的CTAB法提取水稻基因组DNA,经Sau3AI部分酶切的产物经透析袋电洗脱法回收、正丁醇浓缩后,以1∶1的摩尔数比和载体臂连接.包装后测定,文库滴度达到106pfu/ml;随机酶切重组克隆显示,插入片段达到预期的15~23 kb之间,提示该方法适于植物材料高质量基因组文库的构建,有利于分离完整的基因序列及其调控区.     

枯草杆菌启动基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以大肠杆菌启动基因选择载体pHE5为载体,枯草杆菌染色体DNA为供体,克隆了一批启动基因功能片段,带克隆片段的重组质粒在大肠杆菌中表现不同的四环素抗性水平,其中50%在100μg/ml以上,12%达到200μg/ml。对其中一个转化子进行质粒检测和分析,获得一个重组质粒pHE273,经酶切分析证明,克隆的强启动基因位于2.2kb的EcoRI-HindⅢ片段上。     

水稻叶绿体基因文库及物理图谱构建达到国际先进水平

杭州大学生物系和复旦大学协作,共同完成了一项在分子生物学领域居国际领先地位的科研成果——水稻叶绿体DNA基因文库及物理图谱构建。该项研究工作采用的分离纯化水稻ctDNA的方法,具有操作简便、重复性好、得率高以及不经C_3Cl超离心纯化即可用于分子生物学研究的特点,适合于国内实验室的条件应用。建库选用的载体,其克隆容量大,文库完整性好,而且便于快速分析插入     

极端嗜热厌氧纤维素分解菌基因文库的构建及其内切葡聚糖酶基因片段的克隆

以从云南邦拿掌温泉中分离、纯化的高温厌氧纤维素分解菌邦2菌(Cadicellulosiruptor)为材料,制备其总DNA,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ部分酶切后,在T4DNA连接酶的作用下与经EcoRⅠ完全酶切、去磷酸化的质粒载体pUC18连接,然后转化E.coliJM109,建立了邦2的基因文库,经筛选鉴定得到6.3×103个重组子;重组子经刚果红平板验证:约有23.5%菌落呈现透明圈;重组子经EcoRⅠ酶切验证显示:重组质粒均含有外源DNA插入片段.结果表明已克隆到邦2菌纤维素酶系中的内切葡聚糖酶基因(ED基因)片段.     

制备12 kb重组质粒载体的方法

利用质粒载体pGEM-7Zf(+)克隆了一个长达9224bp的DNA片段,重组质粒大小达到12003bp.该重组质粒可以转化到JM109受体菌中,并且在随后的继代培养过程中具有较高的产量和相当高的稳定性.对于利用质粒载体来克隆DNA片段来说,设计的方法具有普遍的使用价值,对于较大的DNA片段克隆,该方法具有简便、可靠的特点,不仅能够保证克隆成功,而且极大的减少了筛选或鉴定重组菌的工作量.     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

人白细胞介素7重组蛋白原核表达载体在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的:构建重组人白细胞介素7(rhIL-7)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并鉴定.方法:以RT-PCR方法扩增编码IL-7的cDNA片段,插入至pET-3d载体中,构建rhIL-7的原核表达载体,阳性克隆经测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3),优化rhIL-7表达条件,利用免疫印迹鉴定重组蛋白.结果:重组载体经DNA测序显示包含正确的rhIL-7编码序列,重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导后外源蛋白表达,相对分子质量为17 400,与IL-7理论分子质量一致;免疫印迹显示,外源蛋白可以被人IL-7特异性抗体识别,表明在原核表达的外源蛋白是rhIL-7.rhIL-7主要表达于包涵体中,包涵体表达优化条件为:温度为37 ℃、IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为4 h.结论:成功的构建了rhIL-7的原核表达载体.     

产毒性大肠杆菌CFA／I基因表达与DNA超螺旋状态的关系

将CFA／I结构基因(cfaABCE)克隆到载体pJRD184上构建了质粒pJGX15A，并将其转入大肠杆菌fDpA野生株E．coli HB101和topA缺陷株E．coli DM800中．Western blot测定的结果表明，在CFA／I的正调控基因cfaD基因缺失时，两株重组菌株都能够表达CFA／I抗原．分别抽提两个重组菌株对数前期和对数中期的质粒pJGX15ADNA，并对其进行氯喹琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示E．coli DM800细胞中质粒pJGX15A的负超螺旋水平比野生型细胞E．coli HB101中的较低．同时，菌落免疫酶斑分析的结果显示DM800受体菌中CFA／I的表达水平比HB101受体菌中的表达水平高．实验结果表明，CFA／I结构基因的表达与DNA负超螺旋水平有明显的负相关性，与负超螺旋促进基因表达的看法不同．     

大黄欧文菌中蔗糖异构酶基因的克隆表达及应用

以大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)NX-5基因组DNA为模板,PCR扩增得到编码蔗糖异构酶(SIase)的基因palⅠ,构建克隆载体pUC18-palⅠ。经测序正确后,将palⅠ亚克隆至表达载体pET-22b(+)上,并在E.coliBL21(DE3)中成功表达相对分子质量约为66 000的可溶性蛋白。通过Ni-NTA柱对表达产物进行纯化,纯酶的比活为40 U/mg。转化条件研究表明:重组菌能够高效转化质量分数为50%的蔗糖溶液,转化液中异麦芽酮糖得率为85%。