温泉菌宏基因组文库的构建

为克隆温泉菌中耐热的新型木聚糖酶基因,通过提取未培养即墨温泉样品的基因组DNA,剪切并末端平头化后,用pUC18质粒为载体连接转化大肠杆菌,构建了一个包括1.2×105左右克隆的宏基因组文库.文库中外源DNA总容量约为3.0×105kb,文库中插入所需大小片段的成功率达87%.     

南极土壤微生物宏基因组文库构建及其抗肿瘤活性初探

微生物代谢产物是药物的重要来源之一，然而采用传统的分离培养筛选的手段仅能对不到1%的微生物资源进行研究开发.通过构建环境样品微生物宏基因组文库能突破人工培养的瓶颈，直接克隆到完整的次级代谢产物合成基因簇，并从中寻找新的药物和活性次生代谢产物.实验直接提取南极中山站排污口土壤样品中微生物总基因组DNA，以黏粒(SuperCos 1)为载体，构建了宏基因组文库，获得了约27 000个克隆子，平均插入片段在35kb以上，覆盖了至少946Mb的微生物基因组信息.通过差异性DNA修复试验(DDRT)法对该文库进行筛选，获得13个具有抗肿瘤活性的克隆子，并采用MTT法对其中活性较高的克隆子进行细胞毒活性测定，表明克隆子AE3对卵巢癌细胞具有明显的生长抑制作用.     

活性污泥宏基因组Fosmid文库的构建

大插入片段宏基因组文库的构建是开发大片段目的基因及分析其结构与功能的基础.文中分别采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、试剂盒及琼脂糖包埋法提取活性污泥宏基因组DNA,其中琼脂糖包埋法获得的DNA片段大于23kbp,利用此DNA成功构建了以pCC1FOS为载体的Fosmid文库,该文库含有5280个克隆,平均插入片段长度为35～40 kbp,共包含约200 Mbp的宏基因组DNA.从此文库中随机挑选200个克隆,利用活性筛选方法快速筛选到了1个含有淀粉酶的阳性克隆,表明活性污泥Fosmid文库可用于功能基因的活性筛选,具有开发新基因的潜力.     

植物共生菌宏基因组文库探秘

微生物泛指一切肉眼看不钊或看不清楚、需要借助显微镜观察的微小生物。虽然微生物个体微小,但是在生物圈中却占有重要地位,它们作为分解者在地球物质循环（如碳循环、氮循环）巾发挥着举足轻重的作用。微生物在自然界巾无处不在,从寒冷的极地到炎热的沙漠,从几万米的高宅到几千米深的海底,从动植物体内到真菌细胞内,凡是我们能够想象到的地方都有它们的踪迹。     

宏基因组技术及其在厌氧消化研究中的应用

在介绍基因（组）富集、基因（组）DNA提取、文库构建及筛选等宏基因组技术的基础上,论述了宏基因组技术在厌氧消化研究中应用的重要性,认为该技术可成为研究微生物群落多样性的首选技术之一,有助于了解厌氧消化微生物的多样性、生态功能和动态变化,揭示厌氧消化微生物学机理,提高厌氧消化效能等.同时宏基因组技术为微生物资源的深层次开发利用提供了技术平台,并在工业、农业、海洋等领域具有广泛的应用前景.     

新型预苯酸脱氢酶基因的克隆和生物信息学分析

采用基于序列特异性直接测序策略,从所构建的碱性污染土壤宏基因组文库中分离得到一个编码预苯酸脱氢酶的新基因pdhE-1,并对新基因进行生物信息学分析和保守区域特征研究。结果表明,pdhE-1编码一个由287个氨基酸编码组成的多肽。在DNA水平上,该基因与来自新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobiumsp.)的预苯酸脱氢酶相似性较高,为82%;在氨基酸水平上,与来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的预苯酸脱氢酶序列相似性为65%,一致性为42%。新型预苯酸脱氢酶基因pdhE-1的克隆和生物信息学分析研究为进一步完成酶基因的功能鉴定奠定了基础。     

自来水中细菌宏基因组DNA的浓度与细菌菌落总数的相关性分析

分析自来水中细菌宏基因组DNA浓度与细菌菌落总数之间的相关性,探索新的自来水细菌菌落总数检测方法。采用国标法检测自来水中的细菌菌落总数约为(165±5)CFU/m L,高于国标限值(100 CFU/m L)。通过计算得出,检测600 m L本实验水样中的细菌菌落总数相当于检测1 000 m L(1 L)100 CFU/m L的自来水。首先将600 m L及低于和高于该体积不同体积梯度的自来水经滤膜过滤收集菌体;然后使用细菌基因组提取试剂盒提取滤膜上的细菌宏基因组DNA,电泳分析提取的宏基因组质量;最后检测各个体积自来水宏基因组DNA浓度,根据检测结果分析自来水中宏基因组DNA含量与细菌菌落总数之间的相关性。提取的自来水宏基因组DNA主条带清晰,可以进行基因组DNA含量测定分析;自来水中细菌宏基因组DNA浓度与细菌菌落总数之间呈正相关的线性关系。建立一种通过检测自来水中细菌宏基因组DNA浓度来反映细菌菌落总数的检测方法,检测灵敏度可达7 CFU/m L,且省时、重复性好。     

基于GPU运算的宏基因组第二代测序模拟软件

提出一个新的宏基因组模拟系统NeSSM（Next—GenerationSequencingSimulatorforMetagenomics）。通过结合目前数据库中所有的基因组信息和一些初步的宏基因组测序信息,该系统可以产生一个接近于实际情况的模拟宏基因组测序数据。为了加快该系统的运行时间,运用了显卡计算（GPU并行化计算）,通过并行化运算有效地缩短了程序运行所需时间。目前,NeSSM支持454和Illumina的测序平台。关键词：宏基因组;GPU;模拟系统;测序平台     

活性污泥宏基因组DNA提取方法优化

宏基因组DNA的成功获取是宏基因组学技术顺利开展的关键.利用溶菌酶-SDS-蛋白酶K法（LSK法）提取活性污泥宏基因组DNA,结合单因素法与表面响应法对提取过程的4个关键步骤进行条件优化,即预处理、细胞裂解、蛋白去除及DNA沉淀过程.确定影响DNA产量的重要因素：预处理缓冲溶液与DNA沉淀剂类型、CTAB质量分数、溶菌酶浓度、37℃水浴时间及SDS质量分数.确定LSK法提取宏基因组DNA的最佳条件：TENC预处理活性污泥;1.5%CTAB;0.5mg/mL溶菌酶,37℃水浴1.4h;2%SDS,200μg/mL蛋白酶,55℃水浴2.5h;异丙醇沉淀DNA 40min.在最佳条件下,活性污泥宏基因组DNA的最大产量为每g污泥170μg.本研究可为环境样品中高质量宏基因组DNA的提取提供有价值的参考.     

宏基因组技术在环境微生物资源开发中应用的探索

环境中约有99%的微生物在现有的条件下不能被培养,这使微生物资源的开发利用受到了限制.宏基因组是指某一特定的环境中全部微生物的总DNA,宏基因组技术是将样品中的总DNA提取出来后,利用适宜的载体克隆到宿主细胞中以构建成宏基因组文库,再筛选新的活性物质或基因,该技术在微生物资源的开发利用上将会有巨大的发展潜力.     

黄河故道湿地可培养细菌多样性及产木聚糖酶菌株筛选

研究黄河故道湿地可培养细菌的多样性及其产木聚糖酶的应用潜力.采用稀释平板涂布法从湿地样品中获得119株菌株,形态去重复后对93株进行16SrRNA基因系统发育分析以及利用刚果红染色法进行木聚糖酶活性筛选.结果表明,分离得到的菌株分属于4个门的18个科、21个属,其中优势类群为变形菌门(Proteobacteria)(41株,44%).该地区可培养细菌的Shannon-Wienner多样性指数H′=3.66,Simpson指数D=0.97;Margalef物种丰富度指数dMa=10.59;Shannon物种均匀度指数E=0.94,且样点青龙湖多样性指数高于样点刘寨.93株代表性菌株的木聚糖酶筛选结果显示,11.82%具有木聚糖酶活性,链霉菌和芽孢杆菌在木聚糖酶活性菌株中比例最高.以上结果表明豫北黄河故道湿地蕴含丰富的细菌资源,可为木聚糖酶的研发提供良好的菌种来源.     

纤维微菌XM-8木聚糖酶基因克隆及酶学性质

【目的】为获得可应用于木聚糖水解的酶资源,希望通过筛选分离得到能够水解木聚糖的木聚糖酶产生菌,克隆表达木聚糖酶基因并研究其酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解木聚糖的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定。扩增其木聚糖酶基因,以pET22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为纤维微菌。通过PCR成功克隆到该菌的木聚糖酶基因(xyn-8a),并构建共表达质粒pET22b-xyn-8a,实现木聚糖酶Xyn-8a的活性表达。酶学性质研究表明Xyn-8a最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,只对木聚糖底物有活性;HPLC分析其水解产物以木二糖为主,还有少量的木糖和木三糖。【结论】XYN-8A在pH值为6的条件下具有较高活力,且可以催化水解反应,在生产低聚木糖方面具有一定的应用价值。     

黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。     

低聚木糖生产用木聚糖酶的制备和测定

采用沉淀剂G处理黑曲霉1—13菌株的粗酶液获得木聚糖酶制剂。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳酶谱分析测定该酶制剂为单-木聚糖酶组分。经一系列研究结果表明,该酶制剂无β-木糖苷酶活力和羧甲基纤维素酶活力,水解玉米芯木聚糖的产物主要为木二糖和少量木糖。由此可见,此木聚糖酶制剂的底物专一性较强,可直接以玉米芯为底物,选择性水解玉米芯中的木聚糖,生产低聚木糖。     

地衣芽孢杆菌基因文库的构建及分析

作为一种高效无毒、无二次污染以及能够生物降解的水处理剂,生物絮凝剂受到越来越多的关注.以一株具有强絮凝活性地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为实验菌,通过构建基因组文库,尝试筛选絮凝基因阳性克隆子.结果表明,该菌株基因文库构建成功,共得到2.1×103克隆子.随机挑取17个阳性克隆子进行DNA测序分析,发现一些相对保守蛋白及2个不具有明确功能的基因.该结果为进一步研究地衣芽孢杆菌全基因组结构功能及细菌絮凝基因奠定了基础.     

木聚糖酶高产微生物的筛选和鉴定

利用蔗渣木聚糖为惟一碳源，从甘蔗根部泥土样口中分离得到一株产木聚糖酶活力较高的菌株，经形态、生理及生化鉴定，初步确定为蜂房芽孢杆菌；同时研究了碳源、氮源对该菌产木聚糖酶的影响。结果表明，其最适碳源为木聚糖，最适氮源为酵母浸膏和硝酸铵的混合氮源；在装料100mL的250mL三角摇瓶中于32℃、120rpm振荡培养40-44h后，发酵液中木聚糖酶活力高达3839.5Iu/mL，具有工业开发前景。