用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定

以优良杂交水稻的恢复系明恢63为材料，构建覆盖水稻基因组的cDNA文库，用于功能基因组的研究。选择水稻全生育期过程的9个时期的不同组织和病原诱导的组织分别构建了15个定向cDNA文库。依据基因组DNA饱和杂交的原理，将从15个独立的cDNA文库中提取的质粒混合，并与固定有磁珠上具有互补性的2份基因组DNA亲和体系饱和杂交，收集杂交组分中的质粒并重新转化大肠杆菌，获得全生育期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.4kb，含62000个克隆子。反向Northem杂交显示，该文库收集了众多表达丰度极低的基因以及特异表达的基因。对文库中随机的10750个克隆进行了测序，序列分析比较后获得6399条非重复的EST(expressed sequence tag)序列，非重复序列占59.5％。目前，用该文库制作的cDNA芯片已被用于功能基因组的研究。     

新型杆状病毒穿梭载体及绿色荧光蛋白在棉铃虫中的表达

利用棉铃虫核型多角体病毒的全基因组ＤＮＡ构建转座－穿梭载体Ｈａｎｐｖｉｄ,它既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在棉铃虫细胞中复制形成感染性病毒粒子。Ｈａｎｐｖｉｄ携带转座－穿梭盒,包括原核复制子ｍｉｎｉＦ,卡那霉素抗性基因Ｋａｎ,ＬａｃＺα和Ｔｎ７转座子的接受位点ａｔｔＴｎ７。另一供体质粒以转座的方式将绿色荧光蛋白基因和经亚克隆的多角体蛋白基因整合到Ｈａｎｐｖｉｄ的ａｔｔＴｎ７位点上成为重组病     

甘蓝畸胎瘤的诱导及T-DNA的转移

进行植物遗传工程研究需要把外源的DNA引入到植物的细胞中,继而使其和植物细胞的基因组整合并能表达。致瘤农杆菌(Agrobacterum tumefaciens)的Ti质粒被证明是植物基因转移的良好载体本文作者曾利用致瘤农杆菌诱导龙葵植株产生畸胎瘤,并且在培养条件下,分化出含有胭脂碱合成酶基因的愈伤组织和幼苗,从而完成了T-DNA在龙葵细胞中的转移。Hall和Kemp成功地利用Ti质粒将插入到T-DNA的菜豆贮藏蛋白基因转移到向日葵,在其瘤组织中产生菜豆蛋白的DNA的转录产物,为植物遗传工程的研究展开了一个美好的前景。     

牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性

通过同源重组将pHA2质粒插入到牛Ⅰ型疱疹病毒ZJ分离株基因组的UL15和UL18基因之间, 构建了重组病毒rBHV1-HA; 提取重组病毒的环状基因组DNA, 转化大肠杆菌DH10B, 获得了含有BHV1全基因组的感染性细菌人工染色体克隆pBHV1. pBHV1转染MDBK细胞可以拯救出病毒, 该病毒与野生毒株在细胞上的繁殖特性未见差异. 通过两步Red E/T重组, 构建了gN基因跨膜区缺失的pBHV1突变体, 并转染获得了重组病毒rBHV1-?gN. 病毒繁殖动态曲线显示, rBHV1-?gN的滴度比野生毒株低9%~20%. BHV1感染性克隆的成功构建, 将为研究新型BHV-1基因缺失疫苗和牛的病毒载体疫苗提供技术平台.     

具有高比活性的新木聚糖酶XYNB的酶学性质研究及其编码基因的克隆和表达

纯化了橄榄绿链霉菌A1产生的胞外木聚糖酶XYNB, 并对其酶学性质进行了测定. XYNB具有优良的酶学性质, 最适pH为5.2, 最适温度为60℃, 比活性高达2869.78 U/mg, 对金属离子及EDTA和SDS等具有较好的抗性. 根据木聚糖酶成熟蛋白N端氨基酸序列测序结果设计引物, 克隆了此酶的成熟蛋白编码基因xynB. 基因全长576 bp, (G+C)含量为64.3%, 编码191个氨基酸, 理论分子量为20.839 kD, 是一种新的木聚糖酶基因. 构建了xynB表达载体并在大肠杆菌中得到了表达, 表达产物具有正常的生物学活性.     

基于氨基化SiO2纳米颗粒的新型基因载体

采用正硅酸乙酯与N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法, 制备了大小均匀的氨基化二氧化硅纳米颗粒. 由于表面氨基化使纳米颗粒在一定的pH环境下的x (zeta)电位为正值, 与带负电荷的质粒DNA通过静电结合能快速形成纳米颗粒-质粒DNA复合物, 并对结合的DNA有明显的保护作用. 结合纳米技术、生物技术与基因工程技术, 构建了基于氨基化SiO₂纳米颗粒的新型非病毒型基因载体, 应用这一新型基因载体成功地将绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)表达载体pIRGFP导入COS-7细胞, 并在细胞内产生高水平的绿色荧光蛋白表达.     

基于氨基化SiO2纳米颗粒的新型基因载体

采用正硅酸乙酯与N-（β-氨乙基）-γ-氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，制备了大小均匀的氨基化二氧化硅纳米颗粒，由于表面氨基化使纳米颗粒在一定的pH环境下的ζ(zeta)电位为正值，与带负电荷的质粒DNA通过静电结合能快速形成纳米颗粒-质粒DNA复合物，并对结合的DNA有明显的保护作用，结合纳米技术，生物技术与基因工程技术，构建了基于氨基化SiO2纳米颗粒的新型非病毒型基因载体，应用这一新型基因载体成功地将绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP)表达载体pIRGFP导入COS-7细胞，并在细胞内产生高水平的绿色荧光蛋白表达。     

重组DNA的研究新进展

本世纪70年代初,美国科学家S. Cohen和H. Boyer等首次在体外成功地组建了具有生物功能的重组质粒,1974年,Morrow等将第一个真核基因即瓜蟾rRNA基因导入大肠杆菌,获得克隆,标志着重组DNA(rDNA)研究的开始。rDNA技术,是在试管内用酶及其他物质使不同物种间的DNA分子彼此结合,然后导入细胞内令其行使功能的技术。它涉及五个方面:1)DNA特异的剪切技术——获取目的基因;2)核酸分子杂交技术——鉴定未知核酸分子;3)DNA的分子克隆——目的基因的扩增;4)DNA顺序测定——确立基因的精细结构和功能的关系;5)目的基因的表达——产     

CpG DNA增强口蹄疫病毒DNA疫苗诱发豚鼠产生的免疫应答

CpG DNA是一些具有免疫刺激作用的核苷酸序列,这些序列在DNA疫苗诱发机体产生的免疫应答中起着重要作用。设计并化学合成了一段含CpG DNA的寡核苷酸,将其插入编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶及O型口蹄疫病毒抗原表位融合蛋白的表达质粒中,并观察了其对重组质粒介导的免疫应答的影响。结果显示,插入的寡核苷酸能增强重组质粒诱发豚鼠产生的病毒中和抗体及T细胞增殖反应,并能提高豚鼠的抗病毒感染能力,证明将CpG DNA克隆进DNA疫苗中提高DNA疫苗免疫活性的一条有效途径。同时,构建的DNA疫苗为抗口蹄疫DNA疫羁的应用奠定了一定的基础。     

DNA纳米自组装的研究进展及应用

DNA纳米技术是一种自下而上的分子自组装模式,由分子构造为起点基于核酸分子的物理和化学性质自发地形成稳定结构,遵循严格的核酸碱基配对原则,使得DNA被用作构建结构的材料基元而不是在活细胞中那样作为遗传信息的载体.通过合理地设计碱基链来达成精密控制的纳米级复杂结构的目的,研究人员在这个领域已经建立起诸多二维、三维的复杂纳米结构以及各种具有不同功能的分子机器,比如DNA计算机.本文总结了近年来DNA纳米自组装方面取得的最新进展,同时介绍DNA纳米自组装的几种不同组装方法,并对其相关应用进行了展望.     

酵母Pro2基因的克隆、鉴定及其促抗盐调渗性质的研究

在50年代,脯氨酸合成途径及为其合成酶编码的基因在多种微生物中就有了详尽和深入的研究。在大肠杆菌、沙门氏菌和红色链孢霉菌中,其合成途径为:     

溴乙锭荧光探针法检测三链DNA的形成

早在1957年 Davis 等就曾报道过三链核酸的存在,但当时被认为是一种人为的没有生物学意义的结构而未引起人们的重视.直到1987年 Mirkin 等在酸性溶液的质粒中发现一种 H 型三链 DNA,同年 Dervan 等证实了可通过将第三股 DNA 粘接到含有真实基因的天然 DNA 上形成三链 DNA,才引起人们的广泛关注.目前已经发现,通过三链 DNA 的形成,寡聚核酸可以充当切割 DNA 的“分子剪刀”和提供抑制基因转录的新手段、并可能在发展治疗病毒性疾病(如爱滋病、癌症等)的新型药物等方面具有潜在的应用.鉴于这些原因,发展一种灵敏度较高的有效检测三链 DNA 形成的方法是十分有意义的.溴乙锭(以下     

王百合单染色体DNA文库的构建

以王百合为模式植物建立了简单快速分离植物单染色体及扩增和克隆其DNA的方法 ,即显微操作分离单个染色体并放入Eppendorf管中 ,经Sau 3A酶切后在染色体DNA片段两端加上Sau 3A寡核苷酸人工接头 ,然后以寡核苷酸人工接头中的一条链为引物进行两轮PCR扩增 .PCR产物为 30 0～ 2 50 0bp ,多数为10 0 0bp左右 ,经Southern杂交证实PCR产物来自王百合基因组DNA .对单染色体第二轮PCR产物进行克隆 ,构建单染色体DNA文库 ,得到约 10 0 0 0 0个重组子 .对其中 84个重组子进行分析 ,插入片段为 30 0～180 0bp ,平均为 780bp .与以往方法相比 ,此方法避免了在纳升体积内酶解、连接等操作 ,扩增底物只需一条染色体而不是以往的几十条 ,而且克隆片段 (平均 780bp)大于以往的报道 (平均 6 50bp) .     

基于四链DNA构建纳米结构的研究进展

除DNA双螺旋结构外,DNA分子还可以形成三链和四链等其他二级结构.近些年来人们更加关注四链DNA的研究,包括G-四链体和I-motif结构.一方面由于富G和富C序列存在于基因的重要区域并发挥重要作用;另一方面由于四链结构组装的特殊性和结构柔性,其也常用于构建DNA纳米结构.此前基于双链DNA已经构建出许多纳米结构和材料,并发展出模块组装和DNA折纸等成熟的DNA纳米结构组装方法.本文将重点介绍近些年来富G和富C长链形成的四链DNA纳米结构和以四链结构为基本组装单元构建DNA纳米结构的相关研究进展,并简要介绍四链DNA纳米结构的功能性应用及展望其未来发展方向.     

编码蚯蚓纤溶酶组分A基因的cDNA克隆及表达

蚯蚓纤溶酶组分A是赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内纤溶酶的主要组分之一，具有双重纤溶活性，用逆转录PCR(RT—PCR)的方法从赤子爱胜蚓中克隆了编码蚯蚓纤溶酶组分A的cDNA，由其推测的氨基酸序列与丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶家族的成员具有较高的同源性，而且具有其保守的催化位点，表明该蛋白质可能是胰蛋白酶家族的成员．将上述cDNA导入大肠杆菌的表达载体pQE31和pMAL—c2X，构建表达质粒pQE—efea和pMAL—efea，这2个表达质粒均可以在大肠杆菌苗株M15中诱导表达出与预期大小相近的重组蛋白。其中，pQE—efea表达的His6—EFEa主要以包涵体形式存在，而pMAL—efea表达的重组蛋白MBP—EFEa是可溶性的，并且具有纤溶活性。     

λ噬菌体DNA复制起始的转录激活:体外系统的研究

通过构建重组质粒 ,将λ噬菌体DNA复制原点置于T7启动子控制之下 ,建立了依赖T7RNA聚合酶转录激活的λDNA复制体外纯酶系统 .这一系统的建立为阐明λDNA复制起始的转录激活的分子机理提供了条件 .同时表明 ,λDNA复制起始的转录激活不依赖大肠杆菌RNA聚合酶与复制蛋白之间的特异相互作用 .     

黄瓜线粒体线形类质粒pC4的核酸序列和性质

津研四号黄瓜线粒体中除了主环DNA外,还有4种类质粒（pC1,pC2,pC3,pC4)。电子显微镜观察结果表明pC4为线形类质粒。将pC4克隆至E.coli JM109中,对pC4进行序列测定和分析。pC4全长370bp,是已知的植物线粒体类质粒中最短的,pC4富含AT,有多个正向和反向重复序列,其两端为35bp的正向重复序列。pC4中的ORF都较短,不足以编码有功能的蛋白。对pC4进行同源性检测,发现pC4与线粒体主DNA和叶绿体DNA缺乏同源性,而与核DNA有同源性。在其他没有线粒体类质粒的黄瓜品种核基因组中也存在pC4的同源序列,pC4与黄瓜不同品种核基因组的杂交带型有一定差别。     

链霉菌发育与分化的分子调控

发育分化是现代生物学中一个富有挑战性的前沿领域．链霉菌具有复杂的形态分化周期,从孢子萌发、气生菌丝产生到孢子形成,每一个生长阶段都具有明显的形态特征,为形态分化突变株的鉴定、分化基因的互补克隆和时空表达研究提供了有利的条件．链霉菌的这一特点,是枯草芽孢杆菌、黄色粘细菌等原核生物无可比拟的此外,链霉菌具有复杂的生理分化过程,其产生抗生素的能力尤为引人注目,在目前已知的约１２０００种抗生素中,一半以上是由链霉菌产生的,其中包括许多在人类医药及农业上具有重要用途的抗生素,对这些抗生素生物合成途径中基因…     

卫星DNA沉默载体的改良及其改变矮牵牛叶色和花色的研究

利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)机制可以从基因组序列入手来进行植物基因功能研究, 这是一种反向遗传学方法. 本室曾成功利用中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)的卫星DNA构建了基因沉默的载体. 本研究对该载体进行了改良, 在本氏烟上对Su基因的沉默测试表明, 改良后的载体与原载体诱导沉默的效率没有差别, 但是改良后的载体构建沉默克隆的过程得以简化. 进一步用改良后的沉默载体分别抑制矮牵牛内源基因Su和CHS基因的表达. 含Su基因的沉默载体接种矮牵牛大约2周后, 矮牵牛沿叶脉开始黄化; 含CHS基因的沉默载体接种矮牵牛约1个月后, 新开的牵牛花上出现花色的褪变, 并由单色花变成了杂色花.