普鲁兰酶N端结构域CBM68对酶学性质的影响

碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Modules,CBMs)在普鲁兰酶结构中普遍存在,对酶的催化性质起重要作用.本文将酸性普鲁兰酶Pul B的N端结构域CBM41-X45替换成耐热普鲁兰酶Pul A的N端结构域CBM68,得到重组酶Pul-11,同时将Pul-11的催化结构域替换成Pul A的催化结构域,得到重组酶Pul-12.结果显示,重组酶Pul-11和Pul-12的最适温度均较Pul B提高了10℃,最适pH分别提高了0.5和1;60℃下热稳定性分别提高了41.4%和44.0%;同时,重组酶Pul-11和Pul-12的底物亲和力和催化效率较Pul B也均有一定程度提高.可见,来源于耐热普鲁兰酶的新型底物结构域CBM68对普鲁兰酶的最适作用温度、最适作用pH及催化效率具有重要影响.     

苏云金芽孢杆菌BtR05普鲁兰酶基因pul在重组大肠杆菌中的自诱导表达

以苏云金芽孢杆菌BtR05基因组DNA为模板,PCR扩增得到其普鲁兰酶基因pul,构建了表达载体p ET(K)-Trx-pul,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG和自诱导表达系统分别对该酶基因进行诱导表达。Tricine-SDSPAGE结果表明,普鲁兰酶基因pul可通过自诱导获得大量表达。     

新型Ⅰ型普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质

【目的】筛选并克隆表达高酶活且具有一定热稳定性的新型普鲁兰酶。【方法】克隆Tumebacillus flagellatus GST4的普鲁兰酶基因pulB,构建重组质粒后转化宿主菌大肠杆菌进行诱导表达,再运用亲和层析进行纯化并分析其酶学性质和结构。【结果】pulB在大肠杆菌中实现可溶性表达,发酵液上清酶活力达到78U/mL,粗酶液经纯化后比活力为258U/mg。重组酶PulB最适反应温度和pH值分别为55℃和5.0,在较窄的酸性范围内(pH值4.5~5.5)酶活力比较稳定;对普鲁兰糖的Km=(16.28±0.03)mg/mL,Vmax=(22.05±0.02)μmol·min-1·mg-1。PulB的DNA序列与GenBank数据库里的任何序列都没有同源性,在蛋白质序列上,由基因pulB编码的氨基酸序列与T.aegyptius的环麦芽糖糊精酶相似性最高,BlastX比对的Identities为54%,Positives为69%,SMART结构预测分析发现,pulB具有淀粉酶的结构域。底物特异性分析表明,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉生成线性的低聚糖或麦芽三糖。【结论】重组酶PulB是尚未报道的新型普鲁兰酶,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉,属Ⅰ型普鲁兰酶。     

产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究

普鲁兰降解酶(pullulan degrading enzymes)能够专一水解普鲁兰多糖α-1,6-糖苷键以及特定位置的α-1,4-糖苷键,在工业、食品业、医疗保健等行业中具有重要的应用意义.本研究采用唯一碳源法从稻田土样中培养筛选到21株产普鲁兰降解酶的菌株.对菌株A1的鉴定及其产生的普鲁兰降解酶的分析表明,该菌株为气单胞菌属,其产生的酶属于Ⅰ型普鲁兰酶(Type I pullulanase,EC 3.2.1.41),专一水解普鲁兰多糖α-1,6-糖苷键.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0,具有良好的温度稳定性和适应性;同时在pH为4.0时仍然保留50%的酶活.进一步对A1菌株产酶的发酵条件(pH、温度、时间)进行了优化,摇瓶中A1分泌表达Ⅰ型普鲁兰酶的水平达到21.2 U/mL.根据已报道的气单胞菌属普鲁兰酶基因的保守序列设计引物,克隆获得了4 053 bp的A1普鲁兰酶基因pluA1全长序列,编码1351个氨基酸.本研究结果为该酶的开发应用奠定了基础.     

极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析

选择来源于极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis(DSM12029)的普鲁兰酶基因,以购自德国菌种保藏中心的基因组为模板,扩增出普鲁兰酶基因TM-pulA;利用酶切酶连构建了重组质粒pET21a-TM-pulA;转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达并经纯化后,进行了水解产物分析和酶学性质测定.结果显示:TM-pulA为Ⅰ型普鲁兰酶,最适pH为5.8;最适温度是80℃;70℃下半衰期为4.75 h;Mn~(2+)、Co~(2+)、AL~(3+)、Fe~(3+)、SDS及EDTA对其酶活有不同程度的抑制作用;该酶的K_m、V_(max)、K_(cat)及K_(cat)/Km值分别为4.68 g·L~(-1)、0.0085 mmol·L~(-1)·s~(-1)、71.18 s~(-1)、15.21 L·g~(-1)·s~(-1).     

一株碱性普鲁兰酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

以普鲁兰糖为唯一碳源,利用平板涂布法从海泥中分离到一株产碱性普鲁兰酶的细菌M25,结合菌株形态特征观察和16S rDNA基因序列分析,确定该菌株为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.).该菌在30℃、200 r/min条件下培养18 h达到产酶最高峰,其合成普鲁兰酶的模式属于同步合成型.酶学性质研究表明:该普鲁兰酶的最适作用温度是50℃,在70℃下保温2 h活力残留50%以上;最适作用pH值为8.0,在pH值6.0~9.0较稳定.实验结果显示该菌所产普鲁兰酶具有较好的温度稳定性和pH稳定性.     

粘质沙雷氏菌低温脂肪酶的基因克隆与酶学性质分析

克隆一个源于北极冻土沙雷氏菌的脂肪酶基因lip18,实现其在大肠杆菌中的表达,并进行酶学性质研究.克隆脂肪酶基因lip18,并构建p ET-28a(+)-lip18重组表达载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导优化重组蛋白表达,并研究其酶学性质.克隆得到脂肪酶基因lip18,全长为1 842 bp,编码614个氨基酸.重组菌的诱导温度对蛋白表达影响很大,在最适诱导温度为20℃时脂肪酶大量表达,重组脂肪酶的相对分子质量约为65 ku.酶学性质研究表明:重组酶高效水解C10~C16的中、长链脂肪酸,最适作用温度30℃,最适作用pH值7.0,并且在0℃条件下有一定的催化活性,热稳定性差,是低温中性脂肪酶;同时,对有机溶剂有较好的耐受性.     

产普鲁兰酶克雷伯氏菌的分离鉴定及酶学性质研究

利用曲里苯蓝法从淀粉加工厂废水氧化池酸性污泥样品中筛选普鲁兰酶产生菌,对筛选到的GXAS-38菌株进行形态观察、生理生化特征分析、16SrDNA序列系统发育分析和普鲁兰酶酶学性质研究,并用PCR方法克隆GXAS-38菌株的普鲁兰酶基因。结果表明,GXAS-38菌株属于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),其产普鲁兰酶的最适反应温度为60℃,在温度35～50℃时酶活较稳定;最适反应pH值5.5,在pH值5.0～7.5时酶活较稳定。Ca2+、Na+和Li+对GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性有激活作用;Cu2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+和Ba2+对GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性有抑制作用;螯合剂EDTA能够强烈地抑制GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性,GXAS-38菌株的普鲁兰酶反应需要金属离子参与。GXAS-38菌株完整的普鲁兰酶编码基因全长3291bp,编码1096个氨基酸。     

产气气杆菌产普鲁兰酶发酵培养基的优化

对一株产气气杆菌产普鲁兰酶的发酵培养基进行了优化,确定了该菌株的最适发酵培养基配方为(g/L):玉米淀粉 15,豆饼粉 10,CH3COONH4 8,K2HPO4·3H2O 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,KCl 0.5,FeSO4·7H2O 0.05.采用该培养基在5 L 发酵罐水平发酵 55h,普鲁兰酶活力达到 54.64 U/mL.研究了不同铵盐形式对该菌株产普鲁兰酶的影响,结果发现:以CH3COONH4为无机氮源,该菌株产普鲁兰酶活力高,且该酶绝大部分能分泌至胞外.而以NH4Cl,NH4NO3及(NH4)2SO4为无机氮源,该菌产普鲁兰酶活力较低,且为胞内酶.     

水稻细胞分裂氧化酶的原核表达

从水稻日本晴幼叶中提取RNA,以反转产物c DNA为模板PCR扩增得到了细胞分裂素氧化酶基因(CKO),酶切连接到p ET-28a载体上,构建了重组载体p ET-28a-CKO,在大肠杆菌BL21中表达了细胞分裂素氧化酶.     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

紫球藻藻红蛋白α、β亚基在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达

将紫球藻藻红蛋白α、β亚基基因(pe A、pe B)分别插入到毕赤酵母表达载体p AO815和大肠杆菌表达载体p ET-28a中.重组的共表达载体p AO815-pe A-pe B转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,经甲醇诱导、SDS-PAGE电泳及DOT-BLOT分析,发现藻红蛋白表达量低.p ET28a-pe A、p ET28a-pe B表达载体分别转入E.coli BL21,经IPTG诱导,Western Blotting分析,结果显示在约20.1 ku处有特异性蛋白条带,与融合蛋白(Pea-his、Peb-his)预期大小基本一致.     

国内期刊亮点

正乙酸钙不动杆菌磷脂酶C在大肠杆菌中重组表达、纯化及酶学性质江南大学汪艳红等以A.calcoaceticus ATCC17902基因组DNA为模板,PCR扩增得到2段磷脂酶C基因(PLC1、PLC2),构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,实现PLC1、PLC2基因的表达。IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化重组蛋白。成功构建2株产磷脂酶C的重组大肠杆菌并纯化,样品经SDS-PAGE分析在80 k Da附近均出现显著的特异性条带。得到了酶的活性、最适温度、最适p H的等酶     

玉米半胱氨酸蛋白酶的原核表达及酶学性质表征

以玉米基因组DNA为模板扩增获得玉米半胱氨酸蛋白酶基因(zmCP1),先将其克隆至pET-28a(+)原核表达载体中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.对重组酶进行诱导表达后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,经Ni柱纯化后其质量分数大于95%.利用二肽荧光底物(R-AMC)和四肽荧光底物(LAFR-AMC)进行酶反应动力学实验,证明该酶对小底物R-AMC具有更好的亲和力和催化活性.重组酶的酶学性质研究表明,该酶最适温度为55℃,最适pH值为6.0,在90℃下的半衰期为39.82min.     

重组E.coli L-天冬酰胺酶的克隆及表达与纯化

以大肠杆菌菌株(E.coli AS 1.357)基因组为模板,PCR扩增L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因(ans B),构建p MD18-Tans B重组克隆载体和p ET-22b-ans B重组表达载体,转化大肠杆菌BL21宿主菌株,重组工程菌经IPTG诱导表达Ans B蛋白,利用重组His-tag,通过Ni-NTA亲和层析纯化Ans B蛋白,利用SDS-PAGE定性分析Ans B蛋白,考马斯亮蓝法测定Ans B蛋白含量,获得纯化的质量浓度为62.7 mg/L的Ans B表达蛋白。重组L-天门冬酰胺酶的纯化收率为42.28%,酶活达137 IU/m L,较原始菌株的(6.87 IU/m L)提高近20倍,并排除大肠杆菌自身L-天门冬酰胺酶本底表达背景。     

一种灰盖鬼伞外切β-1,3葡聚糖酶基因的克隆与表达

为了简单快速地获取大量的β-1,3葡聚糖酶以研究其在真菌形态发生过程中所发挥的作用,本研究以灰盖鬼伞的c DNA为模板克隆了一种编码外切β-1,3葡聚糖酶的基因,并将该基因插入表达质粒p ET28A(+)中,获得了重组表达质粒p ET28A(+)-exg,转化到E.coli Rosetta菌株中并进行异源重组表达.结果显示,克隆基因的c DNA全长2 415 bp,共编码786个氨基酸;SDS-PAGE电泳表明该基因在E.coli Rosetta菌株中得到了高效表达,重组表达的酶蛋白表观分子量为85 k Da;纯化后获得的表达酶经DNS法测得比活力为45 U/mg.酶学性质测定结果表明,该酶具有β-1,3葡聚糖外切酶活性,以昆布多糖为底物时,最适反应条件为p H 6.0、温度60℃,且有一定的耐热能力和较好的p H稳定性,具有较好的应用前景.     

变形杆菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的展示表达及重组酶的特性

在生物转化处理工业中利用细胞表面展示技术表达脂肪酶作为一种全细胞催化形式具有很大优势,因为脂肪酶展示在细胞表面作为一种固定化酶.以超折叠绿色荧光蛋白的羧基端结构域作为锚定区,构建变形杆菌来源的脂肪酶与羧基端结构域的融合基因.将融合基因插入到p ETsf GFP表达载体中,得到表面展示载体p ETsf GFP-Lip A.将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-Blue宿主菌中经自诱导后,利用免疫荧光显微技术和流式细胞仪分析确定脂肪酶成功展示于大肠杆菌细胞表面.重组酶的最高酶活达到7 009 U/g干细胞,最适反应温度和p H分别为为37℃和8.0,表面活性剂Tirton X-100、Co~(2+)和Ni~(2+)能显著提高脂肪酶的酶活,60%丙酮处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为104%,60%乙醇处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为117%,表明脂肪酶对有机试剂具有很好的耐受性.以上实验结果表明:细胞表面展示技术表达脂肪酶的最大优点为工业化应用提供了坚实的基础.     

结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及活性

以结核分枝杆菌H₃₇Rv基因为模板, PCR反应扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因（ICL）, 将其克隆入原核表达载体pET28b中, 并将pET28b I
CL转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达. 结果表明, ICL蛋白的最佳诱导表达条件为: 温度20 ℃, IPTG终浓度为025 mmol/L, 诱导表达4 h, 在此条件下 ICL实现了高效表达, 以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化ICL蛋白, 纯化程度较高. 酶学性质鉴定表明, 实验获得了具有生物学活性的重组蛋白, 重组ICL的比活力为24 μmol/(mg·min).     

β-琼脂糖酶(AgaA7)在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为研究重组β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的表达产物及其酶学性质,根据GeneBank中β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体pET-22b( )中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并测定其酶学性质.结果表明:重组酶的相对分子质量为~5.0×104,与预期相符.此酶最适反应pH是7.0,在pH58的缓冲液中最稳定;最适反应温度为50℃,在低于50℃时比较稳定.Na ,K ,Ca2 ,Mg2 对重组酶活性影响不大,而Zn2 ,Hg2 ,Pb2 则对酶活性具有不可逆抑制作用.     

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.